布鲁辛D通过靶向FAK/LRG1信号通路抑制乳腺癌增殖与迁移的机制研究

《Scientific Reports》：Brucein D suppresses breast cancer proliferation and migration via targeting the FAK/LRG1 signaling pathway

本研究针对乳腺癌治疗中FAK靶向抑制剂临床转化面临的挑战，首次发现天然化合物布鲁辛D(BD)能够通过抑制FAK/LRG1信号轴，诱导线粒体功能障碍和细胞凋亡，有效抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和血管生成。该研究为开发新型FAK抑制剂提供了理论依据，具有重要的转化医学价值。

　　

乳腺癌（Breast Cancer, BC）是全球女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，尽管手术、化疗、放疗等治疗手段不断进步，但肿瘤耐药性和复发转移仍是临床面临的重大挑战。近年来，靶向治疗为乳腺癌患者带来了新的希望，其中黏着斑激酶（Focal Adhesion Kinase, FAK）作为非受体酪氨酸激酶，在多种侵袭性和转移性癌症中过度表达，通过调控细胞增殖、迁移和存活等过程成为备受关注的抗癌靶点。然而，已有FAK小分子抑制剂在临床转化中面临毒性大、口服生物利用度低和耐药性等瓶颈问题。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，中国研究人员将目光投向传统中药鸦胆子（Brucea javanica）的活性成分——布鲁辛D（Brucein D, BD）。前期研究表明BD具有广谱抗癌活性，但其在乳腺癌中是否通过FAK通路发挥作用尚不明确。研究团队通过系统实验证实，BD能够剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和血管生成，同时发现其对正常肝细胞MIHA的毒性显著低于癌细胞，提示BD具有良好的安全性特征。

关键技术方法

研究采用乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231，通过MTT法和集落形成实验评估细胞活力；Transwell实验检测细胞迁移；JC-1染色和ATP检测试剂盒评估线粒体膜电位（ΔΨm）和ATP产量；流式细胞术分析细胞凋亡；RNA测序（RNA-seq）结合KEGG通路富集分析筛选关键信号通路；Western blot验证蛋白表达；DARTS（药物亲和反应靶点稳定性）和分子对接验证BD与FAK的直接结合；临床样本分析包含5对乳腺癌及癌旁组织。

3.1 BD抑制BC细胞增殖、迁移和血管生成

研究人员首先通过MTT实验证实BD以剂量依赖方式抑制乳腺癌细胞活力，对MCF-7、MDA-MB-231和MIHA细胞的IC₅₀值分别为5.1±1.1、5.7±1.1和46.7±3.0 μM，显示其对癌细胞的选择性抑制作用。集落形成实验进一步验证2.0 μM BD可显著抑制乳腺癌细胞克隆形成，而对正常肝细胞影响较小。

Transwell迁移实验显示BD剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞迁移能力，同时通过Western blot检测上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）相关标志物，发现BD上调E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达，下调N-钙黏蛋白（N-cadherin）、MMP9和Snail表达，表明BD通过抑制EMT过程阻碍癌细胞迁移。此外，BD还表现出抑制血管生成的能力。

3.2 BD促进DNA损伤并破坏线粒体生物功能

天然产物通常通过诱导DNA损伤和破坏线粒体功能发挥抗癌作用。免疫荧光实验使用53BP1抗体（DNA双链断裂标志物）证实BD剂量依赖性地增加乳腺癌细胞中53BP1焦点数量，2.0 μM BD处理组在MCF-7和MDA-MB-231细胞中分别诱导约18个DNA损伤焦点。

线粒体为癌细胞无限增殖提供能量基础，研究发现2.0 μM BD将乳腺癌细胞ATP产量降低至对照组的0.51±0.09和0.44±0.05。DCFH-DA和JC-1荧光染色进一步显示BD处理后细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平剂量依赖性上调，线粒体膜电位降低，表明BD通过破坏线粒体功能诱导氧化应激。

3.3 BD通过破坏线粒体功能诱导BC细胞凋亡

线粒体功能障碍最终导致细胞凋亡。Hoechst染色显示BD处理细胞出现明显的核收缩和核碎裂现象。流式细胞术检测进一步证实BD剂量依赖性地促进细胞凋亡，2.0 μM BD处理导致约31.8±1.1%和29.8±4.6%的乳腺癌细胞发生凋亡。Western blot分析凋亡相关蛋白，发现BD下调Bcl-2表达，上调cleaved-caspase 3和BAX表达，进一步验证了BD的促凋亡作用。

3.4 FAK是BC进展和预后的预测标志物

为探究BD的抗癌机制，研究人员通过RNA-seq分析BD处理的MCF-7细胞基因表达谱，KEGG通路富集分析识别出细胞黏附、分子和黏着斑（focal adhesion）为BD调控的关键通路。TCGA数据库分析显示FAK高表达的乳腺癌患者总生存率较低，风险比（Hazard Ratio, HR）为1.616。

临床样本免疫组化和Western blot结果一致显示乳腺癌组织中FAK表达水平显著高于癌旁组织。免疫荧光和Western blot分析证实BD处理降低FAK在细胞核中的分布，并剂量依赖性地抑制FAK磷酸化（p-FAK）。值得注意的是，BD还降低磷酸化Src（p-Src）表达，表明BD破坏FAK-Src复合物形成，阻止Src完全激活。

3.5 FAK是BC细胞的治疗靶点

分子对接分析显示BD与FAK关键残基（LYS-454、GLN-432和ASP-564）形成稳定氢键，结合能为-63.6383 kcal/mol。100 ns分子动力学模拟表明BD-FAK复合物整体稳定且快速达到平衡状态。

DARTS实验显示BD与FAK呈剂量依赖性结合，SIP（溶剂诱导蛋白沉淀）分析表明BD处理增强FAK稳定性，共同证实了BD与FAK之间的直接相互作用。

3.6 BD通过FAK/LRG1信号轴抑制BC细胞增殖和迁移

RNA-seq差异表达基因分析发现富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1（Leucine-Rich Alpha-2-Glycoprotein 1, LRG1）转录水平显著下调。q-PCR和Western blot验证BD处理降低LRG1的mRNA和蛋白表达水平。已知LRG1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥作用，实验结果显示BD剂量依赖性地降低磷酸化PI3K、AKT和mTOR水平，而不影响总蛋白表达。

FAK敲低实验表明，单独沉默FAK即可抑制乳腺癌细胞克隆形成和迁移能力，且与BD联合处理产生更强的协同抑制作用。线粒体膜电位检测发现FAK沉默加剧BD诱导的线粒体功能障碍。分子水平上，FAK敲低不仅降低FAK表达和磷酸化，还导致LRG1下调及PI3K/AKT/mTOR通路抑制，且在FAK沉默细胞中BD处理对LRG1和PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用更为显著。

研究结论与意义

本研究首次阐明BD通过靶向FAK/LRG1信号轴抑制乳腺癌进展的分子机制。BD直接与FAK结合，抑制其磷酸化，进而下调LRG1表达，阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路活化，最终通过诱导线粒体功能障碍和细胞凋亡抑制乳腺癌增殖和迁移。与合成FAK抑制剂相比，BD作为天然产物具有多靶点、安全性高等优势，其双重作用机制（同时靶向FAK信号和线粒体功能）为克服现有靶向治疗耐药性提供了新思路。

研究不仅揭示了BD的抗癌作用机制，也为传统中药活性成分的现代化开发提供了科学依据。尽管BD的生物利用度等药学性质仍需优化，但纳米乳剂等新型递送系统的成功开发为其临床转化铺平了道路。该研究为开发新型FAK抑制剂奠定了理论基础，对推进乳腺癌靶向治疗具有重要意义。