瑞马唑胺通过抑制NF-κB/NLRP3炎症小体焦亡通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

《Scientific Reports》：Remimazolam alleviates cerebral ischemia–reperfusion injury of rats by inhibiting NF-κB/NLRP3 inflammasome pyroptosis

本研究针对脑缺血再灌注（I/R）损伤后神经炎症加剧的临床难题，探讨了新型麻醉药瑞马唑胺（Remimazolam）的神经保护机制。研究人员通过构建大鼠MCAO模型和原代皮层神经元OGD/R模型，发现瑞马唑胺可通过抑制NF-κB/NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路激活，显著降低神经元焦亡（pyroptosis），减少脑梗死体积和神经功能缺损。该研究为瑞马唑胺作为神经保护性麻醉药用于急性缺血性脑卒中治疗提供了实验依据。

　　

脑卒中，特别是缺血性脑卒中，已成为全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。尽管及时的血管再通是目前最有效的治疗手段，但随之而来的再灌注损伤往往会导致脑水肿、出血和进一步的神经元死亡，这使得治疗陷入两难。在急性缺血性脑卒中的血管内治疗中，全身麻醉逐渐成为首选方案，但传统麻醉药物可能引起低血压，反而加重脑缺血损伤。因此，寻找一种既能维持术中血流动力学稳定，又能对缺血脑组织产生保护作用的麻醉药物，成为临床麻醉学和神经科学领域亟待解决的关键问题。

神经炎症在缺血性脑卒中的病理生理过程中扮演着核心角色。其中，NLRP3炎症小体的激活被认为是驱动神经炎症的关键环节。当NLRP3炎症小体被激活后，会切割Gasdermin D（GSDMD）蛋白，其N端片段在细胞膜上形成孔洞，导致细胞肿胀、破裂，并释放大量白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子，这种细胞死亡方式被称为“焦亡”。值得注意的是，NLRP3炎症小体的“启动”和“激活”两个步骤都受到核因子κB（NF-κB）信号通路的严密调控。那么，能否通过药物干预NF-κB/NLRP3通路，来抑制神经元焦亡，从而减轻脑缺血再灌注损伤呢？

瑞马唑胺是一种新型超短效苯二氮?类静脉麻醉药，它通过激活γ-氨基丁酸A型（GABA_A）受体发挥镇静作用，具有起效迅速、苏醒快、血流动力学稳定、呼吸抑制轻等优点。前期研究提示，GABA_A受体在脑缺血后表达下降，而增强其功能可能对急性脑缺血损伤具有保护作用。然而，作为GABA_A受体激动剂的瑞马唑胺，是否对急性缺血性脑卒中具有保护效应？其具体机制是否与调控NF-κB/NLRP3焦亡通路有关？这些问题尚不明确。为了解决这些科学问题，研究人员在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。

为了开展这项研究，作者团队运用了几项关键的技术方法。他们建立了大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型模拟在体脑缺血再灌注（I/R）损伤，并培养了原代大鼠皮层神经元进行氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理模拟体外缺血样损伤。通过TTC染色评估脑梗死体积，Longa评分法评估神经功能缺损。细胞水平上，采用CCK-8法和乳酸脱氢酶（LDH）释放检测评估神经元活性和损伤。利用透射电子显微镜（TEM）观察神经元焦亡的形态学特征。通过实时定量PCR（qPCR）、蛋白质印迹（Western Blotting）和免疫荧光技术检测NF-κB/NLRP3炎症小体通路相关分子（NF-κB p65, NLRP3, ASC, Caspase-1, GSDMD）的mRNA和蛋白表达水平。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎症因子IL-1β的释放。此外，还使用了NF-κB抑制剂JSH-23和NLRP3抑制剂MCC950作为工具药进行机制验证。

瑞马唑胺减轻MCAO大鼠脑梗死体积和神经功能缺损

研究人员首先在动物模型中验证瑞马唑胺的保护作用。结果显示，与假手术组（Sham）相比，模型组（MCAO）大鼠脑梗死体积显著增大，神经功能缺损评分显著升高。在再灌注后立即通过尾静脉给予不同剂量瑞马唑胺（5, 10, 20 mg/kg）干预后发现，10 mg/kg（R10组）的瑞马唑胺能最有效地减小脑梗死体积并改善神经功能评分，而5 mg/kg（R5组）和20 mg/kg（R20组）的效果相对较弱，提示瑞马唑胺的神经保护作用并非简单的剂量依赖性，存在一个最佳有效浓度窗口。

瑞马唑胺提高OGD/R皮层神经元活力

在体外实验中，研究人员确认了原代皮层神经元的纯度高达96.2%后，进行了不同浓度瑞马唑胺（1, 10, 20, 50 μM）的处理。形态学观察和CCK-8检测结果表明，当瑞马唑胺浓度低于20 μM时，对正常神经元活力无影响；而在OGD/R损伤后，瑞马唑胺（特别是10 μM，即R10组）能显著提高神经元活力，减少LDH的释放，表明其能减轻OGD/R诱导的神经元损伤。

瑞马唑胺减轻体内外皮层神经元焦亡

透射电镜（TEM）观察提供了焦亡发生的直接形态学证据。在MCAO大鼠的缺血皮层和经历OGD/R的神经元中，均观察到细胞膜出现穿孔、破裂等典型的焦亡特征。而经过瑞马唑胺（R10）干预后，这种细胞膜的孔洞形成明显减少，表明瑞马唑胺能够抑制缺血再灌注诱导的神经元焦亡。

瑞马唑胺减少皮层神经元NLRP3/ASC/Caspase-1炎症小体介导的焦亡

为了探究瑞马唑胺是否通过影响NLRP3炎症小体通路来发挥保护作用，研究人员检测了通路关键分子的表达。在体实验和体外实验均一致显示，与对照组相比，模型组（MCAO或OGD/R）中NLRP3、ASC、GSDMD、Caspase-1的mRNA和蛋白表达水平均显著上调，同时炎症因子IL-1β的释放也大幅增加。而瑞马唑胺（R10）处理则能显著逆转这些分子的异常高表达，降低IL-1β的水平。这表明瑞马唑胺确实能够抑制NLRP3/ASC/Caspase-1炎症小体的活化及其介导的焦亡过程。

瑞马唑胺通过抑制NF-κB通路激活来减轻NLRP3/ASC/Caspase-1炎症小体焦亡

接下来，研究深入探讨了上游调控机制。通过使用NF-κB抑制剂JSH-23和NLRP3抑制剂MCC950作为阳性对照，研究人员发现，抑制NF-κB（JSH-23组）能够同时下调NF-κB p65及其下游NLRP3、ASC、Caspase-1的表达，并减少IL-1β的释放。然而，抑制NLRP3（MCC950组）虽然能降低NLRP3及其下游分子的表达和IL-1β释放，却对NF-κB p65的表达没有显著影响。这一结果清晰地表明，在脑缺血再灌注损伤中，NF-κB位于NLRP3的上游，其激活是NLRP3炎症小体启动的前提。瑞马唑胺的作用模式与JSH-23相似，能够抑制NF-κB的活化，进而阻断整个炎症小体通路。

综上所述，本研究通过系统的在体和体外实验证明，瑞马唑胺能够通过抑制NF-κB信号通路的激活，进而阻碍其下游NLRP3/ASC/Caspase-1炎症小体的组装与活化，最终减轻脑缺血再灌注后皮层神经元的焦亡，发挥神经保护作用。这项研究不仅阐明了瑞马唑胺一种全新的神经保护机制——靶向NF-κB/NLRP3焦亡轴，而且为其在急性缺血性脑卒中患者血管内治疗麻醉中的应用提供了重要的理论依据和实验支持。相较于其他麻醉药物，瑞马唑胺兼具血流动力学稳定和明确抗炎、抗焦亡的双重优势，展现出良好的临床转化前景。当然，该研究也存在一些局限性，例如未在伴有高血压、糖尿病等共病的动物模型中进行验证，也未探讨瑞马唑胺对其他脑内细胞（如小胶质细胞）焦亡的影响。未来研究可进一步在这些方面深入探索，以更全面地评估瑞马唑胺的神经保护价值。