欧洲鲈鱼白肌原代细胞模型的建立及其在肌肉生成分子机制解析中的应用

《Scientific Reports》：Characterization of myogenesis in European sea bass (Dicentrarchus labrax) using primary white muscle cell cultures

本研究针对欧洲鲈鱼骨骼肌发育分子机制不清的问题，通过建立其白肌原代细胞培养模型，系统解析了12天体外肌生成过程中细胞增殖、分化与成熟的动态规律。研究结合免疫荧光（Pcna、Myod、Myhc）及qPCR技术，揭示了MRFs（myf5、myod1/2、myog、mrf4）、Wnt信号通路（wnt4、wnt5a/b）、Gh/Igf轴（igf-1/2、igf-1r a/b）及蛋白代谢通路（Akt/mTor、泛素-蛋白酶体系统）的时序性调控网络，为鱼类肌肉生物学研究和 aquaculture 育种优化提供了重要理论依据和技术平台。

　　

在水产养殖领域，欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）作为地中海地区的重要经济鱼种，其骨骼肌占体重的绝大部分，直接决定了鱼类的生长性能和肉质品质。然而，相较于哺乳动物，人们对鱼类肌肉发育的分子调控机制知之甚少，这严重制约了通过遗传育种或营养调控手段提升鲈鱼养殖效益的进程。传统的体内研究往往受到生物体复杂内环境的干扰，难以精确解析特定基因或通路的功能。因此，建立一个能够模拟体内肌肉发育过程的体外细胞模型，成为深入探索鲈鱼肌生成（Myogenesis）奥秘的迫切需求。

为了解决这一难题，来自巴塞罗那大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新成果。他们成功地从欧洲鲈鱼的白骨骼肌中分离出卫星细胞（Satellite Cells），并首次建立了该物种的原代肌肉细胞培养体系。研究人员对这一模型进行了长达12天的细致观察和分析，旨在描绘出一幅完整的欧洲鲈鱼肌生成分子图谱。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了几项关键技术。首先，他们从约30尾、平均体重12克的欧洲鲈鱼幼鱼白肌组织中，通过胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离获得肌肉细胞，并在经多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的培养板中进行原代培养。其次，研究利用免疫荧光技术，在不同时间点（第2、4、6、8、10、12天）对细胞进行染色，检测了增殖细胞核抗原（Pcna）、生肌决定蛋白（Myod）和肌球蛋白重链（Myhc）的表达与定位，并定量分析了阳性细胞比例、肌管直径和核含量。最后，他们通过实时荧光定量PCR（qPCR）技术，系统检测了涵盖卫星细胞激活、肌源性调控因子、细胞周期、信号通路、蛋白合成与降解等在内的60多个基因的表达动态。

3.1. 细胞培养的形态学特征和免疫荧光分析

研究人员通过每日的明场显微镜观察，记录了细胞从单个核的卫星细胞激活，到增殖形成单核肌母细胞，再到融合形成多核肌管，最终发育为具有收缩结构的肌纤维的全过程。免疫荧光结果显示，细胞增殖在培养第4至6天达到高峰，此时约80%的细胞呈现Pcna阳性信号。与此同时，生肌决定蛋白Myod在培养早期（第2天）就有超过80%的细胞表达，并持续高表达至第8天，表明卫星细胞被快速激活并定向为肌源性谱系。标志着终末分化的肌球蛋白重链Myhc阳性细胞最早出现在第4天，其覆盖面积、肌管直径以及肌管内核数量均随培养时间显著增加，至第10-12天达到峰值。尤为重要的是，通过Myhc与肌动蛋白（F-actin）的双重标记，研究发现在第8天左右，肌动蛋白开始组装成有序的肌节样结构，条纹清晰可见，这证实了培养细胞正在向功能性的肌肉组织成熟。

3.2. 肌生成过程的转录调控

基因表达分析揭示了肌生成过程的精细时序调控网络。与卫星细胞激活相关的基因pax3b和pax7在培养初期高表达，随后逐渐下降。肌源性调控因子（MRFs）呈现序贯表达模式：myf5和myod1在早期（第2-4天）高表达，主导增殖；myod2在第8天达到峰值，可能参与向分化的过渡；而主导终末分化的myog和mrf4则在第10天表达最高。细胞周期抑制因子cdkn1a和cdkn1cb以及生长抑制因子mstnb在早期高表达后迅速下调，可能为细胞周期推进和增殖“松刹车”；而cdkn1bb的持续上调则可能促进了分化。

在肌管融合和成熟阶段，一系列关键基因表达上调。细胞骨架调节蛋白Dock5、介导细胞间黏附的钙黏蛋白15（Cdh15）、参与信号转导的小窝蛋白3（Cav3），以及肌细胞融合所必需的肌细胞制造者（Mymk）和肌细胞混合者（Mymx）的基因表达均在第10-12天达到高峰。肌细胞增强因子2（Mef2）家族成员（mef2aa, mef2ca, mef2cb, mef2d）也在此阶段高表达，协同调控肌纤维特化。

信号通路分析显示，Wnt信号通路成员wnt4的表达在后期上调，可能与抑制Mstnb并促进肌管融合有关；wnt5a和wnt5b在第8天出现峰值，提示其在分化中的作用。生长激素/胰岛素样生长因子（Gh/Igf）轴呈现动态变化：igf-1早期高表达后迅速下降，而igf-2则持续上升，提示二者在肌生成中扮演不同角色，igf-2可能作为更重要的自分泌/旁分泌因子。Igf-1受体（igf-1ra, igf-1rb）的表达持续增加，与分化进程同步。蛋白合成关键通路Akt/mTor的成员akt2、mtor及其下游靶点eif4ebp1的表达在培养后期显著上调，反映了成熟肌纤维对蛋白质合成需求的增加。同时，负责蛋白质降解的系统，包括泛素连接酶（murf1, mafbx）、钙蛋白酶（capn1, capn3b）和自噬相关基因（atg12, map1lc3b）的表达也在后期增强，表明活跃的蛋白更新与肌肉重塑。

综上所述，这项研究首次成功建立并系统表征了欧洲鲈鱼白肌原代细胞培养模型，清晰描绘了其体外肌生成过程中细胞事件与分子事件的动态关联。研究不仅证实了许多在脊椎动物中保守的调控机制，如MRFs的序贯表达和Akt/mTor通路的激活，也揭示了欧洲鲈鱼特有的调控特征，如igf-2相较于igf-1可能发挥更主导的作用。该模型的建立为未来在可控环境下筛选促进肌肉生长或改善肉质的化合物、营养素提供了强大的平台，对推动鲈鱼精准养殖和细胞培养鱼肉生产等生物技术应用具有重要的理论与实践意义。