基于果蝇单条X染色体遗传效应的CRISPR-Cas9脱靶有害突变评估

《Functional & Integrative Genomics》：Genetic evaluation of CRISPR-Cas9 off-target effects from deleterious mutations on Drosophila male single X chromosome

本研究针对CRISPR-Cas9基因组编辑技术存在的脱靶效应问题，通过利用果蝇雄性单条X染色体的遗传特性，开展了关于脱靶有害突变的系统性评估。研究人员通过设计特异性sgRNA靶向非必需常染色体基因，结合多种nosCas9品系，以雄性存活率和表型为敏感读值，发现CRISPR-Cas9并未引起大规模有害的X连锁脱靶突变。该结果支持了CRISPR-Cas9在体内的精确性，并将脱靶评估指标整合至PlatinumCRISPr设计平台，为优化sgRNA选择、提升基因编辑可靠性提供了重要依据。

　　

基因组编辑技术CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）-Cas9（CRISPR-associated nuclease protein 9）的出现为生命科学研究带来了革命性的变化，它能够像一把“分子剪刀”一样，在RNA的引导下精准切割特定的DNA序列，从而实现对基因组的定点修改。然而，这把“剪刀”是否足够精确，会不会在非目标位置（即“脱靶”位点）造成意外的切割，一直是科学家们担忧的问题。尤其是在临床基因治疗等应用场景中，脱靶效应可能导致细胞功能异常甚至癌变，因此对CRISPR-Cas9脱靶活性的准确评估至关重要。

以往的研究多在培养的细胞中进行脱靶效应检测，例如在人类U2OS细胞系中，某些sgRNA（single guide RNA）的脱靶插入缺失（indel）效率甚至高达63%，平均每个sgRNA可能产生约5个脱靶位点。在斑马鱼、小鼠等模式生物中也观察到了显著的脱靶现象。然而，在经典的模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，这一问题尚未得到系统性的评估。果蝇具有独特的遗传学优势：雄性果蝇只有一条X染色体，而雌性有两条。这意味着，如果CRISPR-Cas9在雄性生殖细胞中对X染色体上的必需基因产生了有害的脱靶突变，由于没有另一条正常的X染色体进行补偿，就会直接导致雄性后代死亡或出现可见的异常表型。因此，利用果蝇雄性单条X染色体的特性，可以作为一个极其敏感的生物传感器，来检测CRISPR-Cas9是否引发了有害的脱靶效应。

为了回答CRISPR-Cas9在活体果蝇中是否会引起有害的脱靶突变这一问题，研究人员在《Functional & Integrative Genomics》上发表了他们的研究成果。他们设计了一套巧妙的遗传学实验方案：首先，让携带由纳米斯（nanos）启动子驱动的Cas9基因的雌蝇（该启动子能特异性地在雌性生殖细胞中高效表达Cas9）与携带一对sgRNA的雄蝇杂交，这对sgRNA靶向的是位于常染色体上的、已知敲除后仍能存活的非必需基因（如Ythdf, Ythdc1等）。它们的后代雌蝇的生殖细胞中同时存在Cas9和sgRNA，形成了有活性的基因编辑复合体。然后，将这些雌蝇与野生型雄蝇进行第二轮杂交。如果CRISPR-Cas9在雌蝇生殖细胞发育过程中，对X染色体上的必需基因产生了脱靶切割并导致有害突变，那么在第二轮杂交产生的后代中，雄性的数量就会显著减少（因为致命的X连锁突变），或者存活的雄性会出现异常表型。通过精确统计后代中雄性与雌性的比例（雄性存活率）并观察表型，就可以灵敏地反映出脱靶效应的严重程度。

本研究主要运用了果蝇遗传学杂交实验、生物信息学序列分析以及统计学分析等关键技术方法。研究使用了果蝇野生型品系及4种不同的nosCas9转基因品系，通过特定的杂交策略，以雄性存活率为主要表型读值。利用CAS-OFFinder工具对sgRNA进行脱靶位点预测，允许最多5个错配或1个凸起（bulge），并聚焦于X染色体上致死基因的编码区。统计显著性采用卡方检验进行评估。

结果与讨论

CRISPR-Cas9未诱导大规模有害脱靶效应

研究人员测试了针对5个常染色体靶点（Ythdf, Ythdc1, Nsun6, RBM5以及旁系同源基因Oatp58Da-c）的10条sgRNA（每靶点一对），并使用了4种不同的nosCas9插入品系（nosCas92-w⁺, nosCas93-w⁺, nosCas92-GFP, nosCas93-GFP）。实验结果显示，在所有测试的sgRNA组合和Cas9品系中，与野生型对照或仅表达Cas9的对照组相比，F1代雄性果蝇的存活率均未出现显著降低，也未观察到任何可见的异常表型。唯一一个显示出统计学差异（p=0.04）的情况是使用nosCas92-w⁺品系靶向Ythdf基因时，雄性存活率略有上升，但研究人员分析认为这更可能是由于Ythdf基因缺失本身影响了雌性的性别决定和剂量补偿过程，从而导致雌性存活率相对下降所致，而非雄性存活率真正提高。这些数据综合表明，在实验条件下，CRISPR-Cas9/sgRNA复合体并未在果蝇体内引发大规模的、足以导致X连锁致死或显著表型异常的有害脱靶突变。

X染色体致死基因中的潜在脱靶位点分析

为了从序列层面评估风险，研究人员使用生物信息学工具对所用sgRNA进行了脱靶预测。他们针对sgRNA靶序列前的19个核苷酸（紧邻PAM序列前），允许最多5个错配或存在1个凸起核苷酸的情况下，在果蝇X染色体上搜索潜在的脱靶位点，并特别关注那些已知的致死基因的编码区。分析结果显示，在X染色体上的182个致死基因中，共存在764个潜在的脱靶切割位点。这意味着，如果CRISPR-Cas9的脱靶活性很高，这些位点被击中后理论上可能引发雄性致死。然而，实际的遗传学实验结果并未观察到预期的致死效应，这说明尽管存在序列上的潜在风险位点，但CRISPR-Cas9在活体果蝇生殖细胞中的实际脱靶切割效率非常低，未能达到产生显著遗传表型的阈值。

与其它研究模型的对比与讨论

研究人员将他们的发现与在其他系统（如培养细胞、小鼠、斑马鱼）中的研究进行了对比。在培养细胞中观察到的高脱靶率，可能源于癌细胞系本身DNA损伤修复系统的缺陷，或者慢性、持续暴露于CRISPR-Cas9编辑系统所致。而在活体动物模型中，情况则更为复杂：一些小鼠研究报道了脱靶效应，但另一些采用三重测序（trio sequencing）的研究则未发现意外的脱靶突变。在斑马鱼中，某些sgRNA确实产生了显著的脱靶，但值得注意的是，其中一些未被PlatinumCRISPr工具预测到，提示除了序列相似性，sgRNA的正确折叠可能也是影响特异性的关键因素。本研究的结果与果蝇体内另一项针对white基因座进行单核苷酸扫描诱变的研究相一致，后者也未能检测到由脱靶效应导致的白眼表型果蝇，共同支持了CRISPR-Cas9在果蝇体内具有较高特异性的观点。

技术优化与工具更新

基于本研究对脱靶效应的评估，研究人员进一步将他们建立的评估标准和参数整合到了已有的sgRNA设计平台——PlatinumCRISPr中。该平台现在能够显示允许最多5个错配的潜在脱靶位点，并强调了sgRNA前15个核苷酸（种子区）对于Cas9切割特异性的关键作用，以及sgRNA二级结构优化的重要性。这为研究人员在不同生物中选择高特异性sgRNA提供了一个更加强大和可靠的框架。

结论

本研究利用黑腹果蝇独特的遗传学模型，通过灵敏的雄性存活率和表型读值，系统地评估了CRISPR-Cas9/sgRNA复合体在体内诱导有害脱靶效应的风险。实验数据表明，在测试的多种sgRNA和Cas9品系组合下，并未检测到由X连锁有害脱靶突变导致的大规模雄性致死或表型异常。这一结果有力地表明，在生理条件下的活体果蝇中，CRISPR-Cas9介导的基因组编辑具有较高的精确性，其脱靶切割事件可以忽略不计，这与在培养细胞中观察到较高脱靶率的情况形成了对比。通过将脱靶评估指标整合进PlatinumCRISPr设计工具，本研究不仅增强了对CRISPR-Cas9技术安全性的信心，也为未来在不同生物中进行更可靠、更精准的基因组工程设计提供了重要的方法学支持和优化策略。