Cordia subcordata二型花柱超级基因的基因组架构与演化：赤霉素途径调控花柱二态性的新机制

《Molecular Biology and Evolution》：Genomic architecture and evolution of heterostyly: New insights from Cordia subcordata (Boraginaceae)

本研究针对二型花柱（heterostyly）这一经典花多态性现象的遗传基础，以自交亲和物种Cordia subcordata为材料，通过染色体级别基因组组装、群体基因组学分析和转基因功能验证，首次在Boraginaceae中揭示了其S-位点（S-locus）的超级基因（supergene）结构。研究发现S-位点包含12个基因，其中8个为S-型（short-styled morph）特有，关键基因CsGA2ox6通过赤霉素（gibberellin）失活调控花柱缩短，并在烟草中诱导出类自交不亲和反应，为花柱二态性演化和自交不亲和性（self-incompatibility, SI）的关联机制提供了新见解。

　　

在开花植物中，二型花柱（heterostyly）是一种引人入胜的花多态性现象。种群由两种花型组成：长花柱型（L-morph）和短花柱型（S-morph），它们的花柱和雄蕊高度呈现交互对应（reciprocal herkogamy），通常还伴随着一种促进异型交配的异型自交不亲和性（heteromorphic self-incompatibility, HSI）。这种精巧的适应性性状被认为是促进异交、减少同型花粉浪费的重要机制。达尔文在其著作《同种植物的不同花型》中就对这一现象进行了深入探讨。然而，尽管其功能意义逐渐被揭示，控制这一复杂多态性的分子遗传架构直到近十年，随着基因组学技术的发展，才在少数几个科中得以解析。

目前的研究表明，二型花柱通常由一个S-位点（S-locus）超级基因（supergene）控制，该区域包含多个紧密连锁的基因，分别调控花柱长度、雄蕊高度、花粉大小和自交不亲和性等性状。一个显著的趋势是，在不同谱系中，S-位点都表现出部分基因在S-型中半合（hemizygous）的特征，这种结构被认为通过抑制重组来维持共适应性状组合的完整性。在调控花柱长度的分子机制上，多个不相关的类群，如报春花属（Primula）、Turnera、Gelsemium等，都独立招募了油菜素甾醇（brassinosteroid, BR）途径，通过BR失活基因（如CYP734A50）来缩短S-型花柱。然而，也有例外，比如荞麦属（Fagopyrum）中的S-ELF3基因，以及木樨科（Oleaceae）中可能涉及赤霉素（gibberellin, GA）调控的基因。这些发现揭示了二型花柱演化中既存在分子收敛，也存在谱系特异性机制。

值得注意的是，大多数二型花柱物种是自交和同型不亲和的。然而，也有一些物种是自交亲和的，例如某些报春花和Gelsemium elegans。这种自交亲和性的获得，往往被认为是HSI系统功能减弱或丧失的结果。研究这些自交亲和的二型花柱物种，有助于将控制花部形态的基因与控制不亲和性的基因功能分离开来，为解析HSI的分子基础提供独特视角。

Cordia subcordata Lam.（紫草科）正是这样一个理想的模型。它是一种自交亲和的二型花柱物种，具有明显的花柱和雄蕊二态性，但缺乏自交不亲和性。这为研究以下关键科学问题提供了机会：1）C. subcordata的S-位点基因组结构如何？是否也表现出半合性？2）能否鉴定出控制花器官二态性的候选基因？它们是否与其他类群中已报道的BR途径基因相似？3）S-位点超级基因是如何组装起来的？是逐步复制（stepwise duplication）还是片段复制（segmental duplication）的结果？4）候选基因是否具有调控性器官长度的功能？特别是，能否通过转基因技术在模式植物中改变花柱长度，并进而影响交配亲和性？

为了回答这些问题，研究人员开展了一项综合性的研究。他们首先为C. subcordata的L-型和S-型个体分别构建了染色体级别的高质量基因组参考序列。通过对33个个体（15个L-型，18个S-型）进行群体基因组重测序分析，结合基因组关联分析（GWAS）和遗传分化（F_ST）分析，在12号染色体上鉴定出了一个约260 kb的候选S-位点区域。该区域包含一个约180 kb的S-型特有半合区域和一个约80 kb的侧翼高分化区域。基因预测显示，该区域共有12个蛋白编码基因，其中8个位于半合区域，为S-型特有。

分子进化分析显示，S-位点区域表现出重组抑制的典型特征：连锁不平衡（LD）衰减更慢，转座子（TE）密度显著增高，核苷酸多样性（π）显著降低。为了探究S-位点基因的起源，研究人员通过系统发育分析和分化时间估算，发现这些基因的复制时间点不同（Ks值在0.11-0.63之间），且其最近旁系同源基因分布于多条染色体上，支持了逐步复制模型的假说，但也不能完全排除片段复制模型。

转录组分析旨在寻找在花型间差异表达的基因。研究人员分别取了两型花在花蕾发育两个阶段（小蕾期和大蕾期）的花柱以及花丝-花冠管组织进行RNA测序。结果发现，在S-位点的12个基因中，有4个基因（CsEAF1, CsGA2ox6, CsSBP, CsUGT87A2.2）仅在S-型中表达。其中，CsGA2ox6特异地在S-型花柱中高表达，而CsSBP则几乎只在S-型的花丝-花冠管中表达。CsGA2ox6编码赤霉素2-氧化酶（gibberellin 2-oxidase），其功能是失活具有生物活性的赤霉素（如GA₁, GA₄），从而抑制细胞伸长。

为了验证这些候选基因的功能，研究人员将它们分别转入本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中过表达。结果发现，过表达CsGA2ox6的转基因烟草花朵明显变小，花柱和花丝长度显著缩短，呈现出类似C. subcordata S-型花的表型，柱头位置低于花药。而过表达CsSBP则使花丝长度有轻微但显著的增加。这些结果证实了CsGA2ox6是控制花柱缩短的关键基因，而CsSBP可能参与促进花丝伸长。

一个更令人惊讶的发现来自对转基因烟草交配亲和性的检测。当对过表达CsGA2ox6的短花柱烟草花朵进行自花授粉时，花粉管在柱头处就被抑制生长，无法进入花柱，从而导致不结实。然而，当将这些转基因短花柱花朵与野生型花朵进行正反交时，花粉管均能正常生长并结实。这表明，CsGA2ox6的过表达不仅导致了花柱缩短，还意外地“唤醒”了一种类自交不亲和反应。虽然在烟草这种具有配子体自交不亲和系统（gametophytic SI）的植物中，CsGA2ox6不太可能直接作为HSI系统发挥作用，但它可能通过扰乱赤霉素平衡，进而影响其他激素（如生长素、脱落酸、乙烯）的稳态，从而间接创造了生理或结构上的障碍，阻止了自花花粉的受精。这一发现暗示CsGA2ox6可能对花柱长度和自交不亲和性都具有多效性（pleiotropic effect），尽管在C. subcordata中，其自交亲和性可能是由于控制不亲和性的其他相关基因发生了突变或表达改变。

本研究主要应用了以下几项关键技术方法：利用PacBio HiFi和Hi-C技术对C. subcordata两种花型进行染色体级别基因组从头组装和注释；通过对中国永兴岛种群33个个体的重测序数据进行覆盖度分析、GWAS和F_ST分析来鉴定S-位点；对花器官不同发育阶段进行转录组测序以筛选候选基因；通过农杆菌介导的遗传转化在本氏烟草中进行候选基因的过表达功能验证；并通过花粉管荧光显微观察和结实率统计评估转基因植物的交配亲和性。

基因组组装与S-位点鉴定

研究人员成功获得了L-型和S-型C. subcordata的高质量基因组组装，大小分别为477.4 Mb和491.3 Mb， scaffold N50均接近30 Mb，BUSCO完整性达98.2%。通过以S-型基因组为参考，分析群体重测序数据的覆盖度，发现12号染色体上一个约240 kb的区域在S-型个体中覆盖度显著高于L-型。进一步精细定位揭示出一个约180 kb的区域在所有L-型个体中完全缺失，而在所有S-型个体中存在，表现出典型的半合性。GWAS和F_ST分析均在该半合区域侧翼约80 kb处检测到与花型显著相关的SNP和高遗传分化，因此将整个约260 kb的区域界定为候选S-位点。该区域包含12个基因，其中8个（Cs12.359-Cs12.366）为S-型特有。PCR验证和微共线性分析进一步证实了这8个基因的半合性。

S-位点的分子进化特征

对S-位点区域的分子进化分析揭示了超级基因的典型特征。连锁不平衡分析显示，S-位点区域的LD衰减速度远慢于侧翼区域和12号染色体的其他部分，表明该区域重组频率较低。转座子密度分析表明，S-位点区域的重复序列含量显著高于其上下游邻近区域，这与非重组基因组区域易于积累重复元件的规律一致。此外，基于S-型个体估算的核苷酸多样性在S-位点区域内也显著降低，这可能是重组抑制和半合性导致有效群体规模减小共同作用的结果。

S-位点基因的起源

为了探究S-位点基因的起源方式，研究人员分析了各基因最近旁系同源基因的基因组位置，并计算了其与S-位点基因之间的同义替换率（Ks）。结果显示，这些旁系同源基因分布在不同的染色体上（如CsTRM5和CsGA2ox6的旁系同源基因在12号染色体上相距>1.7 Mb，Cs12.362的旁系同源基因在13号染色体上），且Ks值差异较大（0.11-0.63）。系统发育分析和基于校准点的分化时间估算表明，CsGA2ox6的分化最早（约39.87百万年前），其次是CsTRM5（约25.04百万年前）、Cs12.362（约23.46百万年前），而CsUGT87A2.1和CsUGT87A2.2之间的复制最晚（约10.92百万年前）。这些异步的复制时间以及旁系同源基因分散的基因组位置，支持S-位点基因是通过逐步复制方式起源的假说，尽管片段复制模型也不能被完全排除。

候选基因的表达与功能验证

转录组分析发现，S-位点基因中，CsGA2ox6在S-型花柱中特异性高表达，而CsSBP在S-型花丝-花冠管中特异性高表达。功能验证实验表明，在本氏烟草中过表达CsGA2ox6能显著缩短花柱和花丝，使柱头位置低于花药，模拟出S-型花的表型。而过表达CsSBP则导致花丝长度轻微增加。这些结果证实了CsGA2ox6是负调控花柱伸长的关键基因，其作用机制可能是通过失活赤霉素来实现的；而CsSBP则可能正向调控花丝伸长。

CsGA2ox6对自交亲和性的影响

对转基因烟草的授粉实验揭示了一个重要现象：过表达CsGA2ox6的短花柱烟草花朵在自花授粉时，花粉管在柱头处生长受阻，不结实；而与野生型花朵进行正反交时，均能正常结实。这表明CsGA2ox6的过表达在烟草中诱导出了类自交不亲和的表现。虽然这种效应可能不是直接的HSI机制，但它提示CsGA2ox6可能对花柱长度和交配亲和性都具有影响，即具有多效性。在C. subcordata中，自交亲和性的获得可能是由于控制不亲和性的其他基因（尤其是控制雄蕊不亲和性的基因）发生了功能改变。

本研究首次在紫草科植物中解析了二型花柱S-位点的基因组结构，揭示了其半合性特征，这与报春花科、亚麻科等多个类群中的发现相一致，体现了分子收敛演化。研究鉴定出CsGA2ox6是控制花柱二态性的关键基因，其通过赤霉素代谢途径发挥作用，这为二型花柱的分子机制提供了新的路径（赤霉素途径），不同于此前在多个类群中发现的油菜素甾醇途径。功能实验不仅证实了CsGA2ox6调控花柱长度的功能，还意外地发现其可能影响自交不亲和性的表达，为理解花部形态与交配系统关联的遗传基础提供了新线索。关于S-位点起源的分析支持了逐步复制模型，深化了对超级基因组装过程的认识。总之，这项研究极大地增进了我们对植物繁育系统多样性遗传基础的理解，特别是在二型花柱这一经典模型的演化机制方面取得了重要进展。未来的研究可以进一步比较具有功能性HSI的Cordia物种，以更精确地揭示HSI丧失的遗传机制，并确认CsGA2ox6在属内功能的双重性。