《Experimental Cell Research》：Canagliflozin inhibits NLRP3 Inflammasome activation to protect the Retinal Neurovascular Unit in a Mouse Retinal Vein Occlusion Model
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视网膜静脉阻塞（RVO）模型中Canagliflozin通过抑制NLRP3炎症小体激活保护神经血管单元（NVUs），降低视网膜非灌注区（RNP）面积，减轻血视网膜屏障（BRB）破坏，减少微胶质细胞活化及视网膜神经节细胞（RGCs）丢失，效果独立于其降血糖和减重作用。
Jixian Ma | Xuan Liu | Yazhou Qin | Yuyao Qu | Qiuping Liu | Jingming Li
西安交通大学第一附属医院眼科，中国西安
摘要
为了研究卡格列净（Canagliflozin）是否通过抑制NLRP3炎性体（inflammasome）的激活来保护小鼠视网膜静脉阻塞（RVO）模型中的神经血管单元（neurovascular units, NVUs），我们在C57BL/6J小鼠中建立了激光诱导的RVO模型，并给予含有卡格列净的饮食。通过眼底荧光素血管造影（fundus fluorescein angiography, FFA）评估视网膜非灌注（retinal non-perfusion, RNP）的形成。使用视网膜平面免疫荧光染色（retinal flat-mount immunofluorescence staining）检测小胶质细胞（microglial cells）的激活和视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）的损失。冷冻切片免疫荧光染色（frozen-section immunofluorescence staining）用于评估Müller胶质细胞（Müller glial cells）的激活，而冷冻切片上的TUNEL染色（TUNEL staining）用于检测RGCs的死亡。Western blotting用于分析血管渗漏和NLRP3炎性体的激活。结果表明，卡格列净减少了RNP的形成，抑制了白蛋白的渗漏，减轻了胶质细胞的激活，减轻了RGCs的损失，并抑制了RVO小鼠中的NLRP3炎性体激活，这些效果与其降糖和减重作用无关。这些发现表明，卡格列净通过抑制NLRP3炎性体的激活来保护小鼠RVO模型中的视网膜NVUs。
引言
视网膜静脉阻塞（RVO）是仅次于糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）的第二大常见视网膜血管疾病，是导致视力障碍的主要原因之一。DR和RVO具有相似的微血管病理机制，包括毛细血管损伤、缺血以及血管生长因子（如血管内皮生长因子，vascular endothelial growth factor, VEGF）的激活，从而加剧毛细血管渗漏和新生血管形成[3]。RVO同时引起视网膜缺血、缺氧和炎症。这导致VEGF和各种炎症细胞因子的表达增加，破坏血-视网膜屏障（blood-retinal barrier, BRB），从而促进黄斑水肿（macular edema, ME）的发生和发展4, 5。作为中枢神经系统的一个组成部分，视网膜通过神经元、血管细胞和胶质细胞之间的协调相互作用形成其神经血管单元（NVUs）[6]。视网膜是体内代谢最活跃的组织之一，对血管功能障碍非常敏感。血流减少会导致缺氧和缺血，从而导致神经元丢失和血管通透性增加。内皮屏障功能的破坏会导致液体渗漏，引起水肿7, 8。这进一步加剧了血-视网膜屏障（BRB）的分解，破坏了NVUs之间的细胞间通讯，并损害了视网膜微血管的结构。因此，这一连锁反应加剧了炎症反应、缺血性损伤，并加速了视网膜神经元的死亡，最终导致不可逆的视力障碍6, 7, 8, 9。目前RVO的临床管理主要针对威胁视力的并发症，而不是阻塞本身，重点在于减轻黄斑水肿（ME）和预防虹膜和/或视网膜中的缺血性新生血管形成10, 11。因此，识别在RVO中起关键作用的信号通路并阐明其调控机制对于丰富RVO的发病机制和建立新的治疗靶点至关重要。
炎性体（inflammasome）的激活是介导炎症反应的关键分子通路之一，也是先天免疫的重要组成部分。它不仅可以由微生物感染或细胞损伤激活，还可以由慢性炎症疾病激活12, 13。炎性体是一种在细胞中形成的多聚蛋白复合体，用于协调宿主对感染因子和生理异常的防御机制[14]。典型的炎性体通常由三部分组成：传感器（sensors）、适配器（adapters）和效应器（effectors）。激活会触发caspase-1介导的pro-IL-1β和pro-IL-18的蛋白水解切割，生成生物活性细胞因子，同时处理gasdermin D（GSDMD）以诱导焦亡（pyroptosis）15, 16。在已识别的各种炎性体家族中，NLRP3炎性体是目前最独特且研究最广泛的炎性体，其名称来源于炎性体中的NLRP3蛋白[17]。目前，已有报道表明NLRP3炎性体参与了糖尿病视网膜病变（DR）、年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration）、青光眼（glaucoma）、白内障（cataract）和干眼综合征（dry eye syndrome）等眼部疾病的发生和发展[18]。然而，NLRP3炎性体在RVO中的作用尚未被报道。
卡格列净（Canagliflozin）是一种钠-葡萄糖共转运体-2抑制剂（sodium-glucose cotransporter-2 inhibitors, SGLT-2i），是一种降糖药物，通过靶向近端肾小管减少葡萄糖的重吸收，从而促进尿糖排泄
[19]。多项研究还证明了SGLT2i在减缓DR进展和降低DME（diabetic macular edema）发病率方面的优势
20, 21, 22, 23。卡格列净心血管评估研究（Canagliflozin Cardiovascular Assessment Study, CANVAS）证明了其在2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）患者中的心血管和肾脏保护作用
24, 25。此外，现实世界的系统评价显示，使用SGLT-2i（包括卡格列净、恩格列净（Empagliflozin）、达格列净（Dapagliflozin）和艾托格列净（Ertugliflozin）的T2DM患者比使用二肽基肽酶-4抑制剂（dipeptidyl peptidase-4 inhibitors, DPP4i）的患者患青光眼和RVO的风险显著降低
26, 27, 28，这突显了其在眼科保护方面的潜在价值。此外，许多动物实验也证明了SGLT2i对糖尿病小鼠视网膜NVUs的保护作用
29, 30，并且其在心血管疾病中的抗炎和抗氧化特性同样显著
32, 33。此外，卡格列净还被证实通过抑制炎症和NLRP3炎性体活性对帕金森病（Parkinson’s disease）具有神经保护作用
[34]。
由于DR和RVO具有相似的微血管病理机制，我们假设卡格列净通过抑制RVO模型中NLRP3炎性体的激活来保护NVUs。
动物和BRVO模型
6-8周大的雄性C57BL/6J实验小鼠从北京伟通利华（Beijing Weitonglihua）购买，并在西安交通大学SPF动物实验中心饲养，室温保持在18至25°C之间，相对湿度保持在40%至70%之间，光照周期为12小时，以维持自然生物节律。所有动物实验程序均获得了西安交通大学动物实验伦理委员会的批准（批准编号：XJTUAE2024-2138）。
C57BL/6J小鼠被随机分配
卡格列净对RVO小鼠体重和血糖的影响
SGLT-2i是一种新型降糖药物。由于其独特的作用机制，它不依赖于胰岛素或胰腺β细胞在体内发挥药理作用。它不仅可以降低血糖和糖化血红蛋白（glycated hemoglobin），还可以改善胰岛β细胞的功能[36]。已有报道指出SGLT-2i在糖尿病中的降糖和减重效果。但在非糖尿病疾病中，SGLT-2i可以独立于降低血糖来发挥作用
讨论
在我们的研究中，我们首次发现了卡格列净对RVO小鼠中NVUs的保护作用，并证明了这一过程可能是通过抑制NLRP3炎性体的激活来实现的。
NVUs是维持视网膜内稳态的解剖结构，也是保持视网膜细胞功能的功能单元。NVUs调节代谢物输送和眼部免疫特权的能力对组织稳态至关重要[46]
CRediT作者贡献声明
Qiuping Liu：撰写 – 审稿与编辑，方法学。
Jingming Li：撰写 – 审稿与编辑，方法学。
Yuyao Qu：数据管理。
Xuan Liu：资源获取，数据管理。
Yazhou Qin：方法学，数据管理。
Jixian Ma：撰写 – 初稿，可视化。
声明
所有动物实验的伦理批准均来自西安交通大学第一附属医院 [XJTUAE2024-2138]。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（No.81960177）；陕西省重点研发计划（2024SF-YBXM-322）；西安交通大学第一附属医院机构基金（No.2024-MS-22）；华南大学引进的博士人才科研启动基金的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文报道工作的财务利益或个人关系。
