Cse1l对细胞存活、颅面和心脏发育至关重要

《Developmental Biology》：Cse1l is Critical for Cell Survival, Craniofacial and Cardiac Development

通过条件敲除Cse1l基因，发现其胚胎致死效应与神经嵴细胞凋亡及p53表达上升相关，揭示Cse1l在颅面发育中调控神经嵴细胞存活的机制。

　　

保罗·P·R·伊亚纳尔（Paul P.R. Iyyanar）| 罗尔夫·W·斯托特曼（Rolf W. Stottmann）

史蒂夫和辛迪·拉斯穆森基因组医学研究所（Steve and Cindy Rasmussen Institute for Genomic Medicine），阿比盖尔·韦克斯纳研究所（Abigail Wexner Research Institute），全国儿童医院（Nationwide Children’s Hospital），俄亥俄州哥伦布市43205，美国

摘要

人类先天性异常导致的死亡率是儿童癌症的两倍。尽管基因组测序和转基因小鼠模型的发展有助于理解其发病机制，但仍存在显著的知识空白。通过正向遗传学方法，我们之前发现了Cse1l基因的变体等位基因anteater，该等位基因表现出多种颅面表型。为了解决这一模型中的变异性问题，我们生成了一个条件性的Cse1l等位基因，并利用Wnt1-Cre2驱动因子在背部中线处将其基因敲除，从而影响了部分神经系统和颅神经嵴细胞。分析结果显示，Wnt1-Cre2; Cse1l^CRISPR/flox胚胎在前脑、中脑和后脑出现严重畸形，同时前鼻部、上颌骨和下颌骨以及第二咽弓发育严重受阻。Wnt1-Cre2; Cse1l^CRISPR/flox胚胎在E11.5阶段因心室心肌增殖缺陷而死亡。Wnt1-Cre2; Cse1l^CRISPR/flox胚胎在E9.5阶段受影响组织的凋亡增加，p53表达也升高。这些数据共同表明CSE1L在神经嵴细胞发育过程中具有此前未知的关键作用。

引言

先天性异常影响约5%的人类人口，其导致的年死亡率是儿童癌症的两倍（Bower等人，2010年；Stallings等人，2024年）。尽管下一代测序和转基因模型取得了进展，但这些畸形的遗传、细胞和分子机制仍不完全清楚。为了研究与结构出生缺陷相关的新基因，我们之前使用N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）诱变筛选方法，发现Chromosome Segregation 1 Like (Cse1l)（先前称为Cellular Apoptosis Susceptibility (Cas)和Exportin-2 (Xpo2)是颅面发育的调控因子（Blizzard等人，2021年）。根据其鼻部特征，我们将这种Cse1l的变体等位基因命名为Cse1l^anterater（Blizzard等人，2021年）。Cse1l^anterater纯合子突变体表现出从严重鼻部畸形到接近正常形态的多种表型。这些畸形包括无眼症或小眼症、唇裂/腭裂、无脑畸形和多指（Blizzard等人，2021年）。这些畸形与E10.5时Cse1l在发育中的前脑、眼睛、舌头、下颌弓、鼻窝、侧鼻突及未来鼻上皮中的表达一致（Blizzard等人，2021年）。然而，这种变异性使得无法针对Cse1l在发育过程中的作用进行深入的分子研究。

Cse1l不仅在发育生物学领域得到研究，在细胞中也具有多效性。多项体外研究表明，Cse1l的缺失或减少会导致凋亡增加和细胞增殖或细胞周期停滞（Liao等人，2008年；Lin等人，2021年；Tai等人，2010年；Zhang等人，2021年）。Cse1l的缺失还与癌细胞类型的迁移和侵袭能力下降有关（Lorenzato等人，2013年）。有趣的是，CSE1L还与染色质相互作用并调控p53靶基因的表达（Tanaka等人，2007年）。CSE1L参与核内货物蛋白的运输，通过将importin-α从核内回收至细胞质以供下一个蛋白质运输周期使用（Kutay等人，1997年）。这一过程有助于维持某些甲基化基因的抑制状态。CSE1L对TAZ的核内积累至关重要（Nagashima等人，2021年）。TAZ对神经嵴细胞发育至关重要，而CSE1l的缺失可能会改变其核内积累情况（Wang等人，2016年；Nagashima等人，2021年）。沉默Cse1l会导致HDAC1、HDAC2和HDAC8等HDACs的核内积累失败，这些HDACs调控下游靶基因的甲基化状态（Dong等人，2018年）。

尽管在体外中对Cse1l在癌细胞中的作用进行了大量研究，但在体内，尤其是在发育过程中的作用仍知之甚少。这是由于Cse1l^null/null纯合体在早期胚胎阶段就具有致死性（Bera等人，2001年）。因此，为了研究Cse1l在颅面发育中的作用，我们生成了一个条件性的Cse1l等位基因，并在神经嵴细胞中将其失活。Cse1l在神经嵴中的敲除导致E11.5阶段胚胎死亡，突变体因神经嵴细胞大量凋亡而出现面部突起发育不良。这些数据揭示了Cse1l在胚胎发育过程中的新体内功能。

小鼠和动物饲养

本研究中使用了Cse1l^CRISPR/wt（Blizzard等人，2021年）、Wnt1-Cre（Danielian等人，1998年）、Wnt1-Cre2（JAX:022501）（Lewis等人，2013年）、Sox2-Cre（JAX:008454）（Hayashi等人，2002年）、Rosa^mTmG（JAX:007676）（Muzumdar等人，2007年）、Trp53^dell/wt（Jacks等人，1994年）以及一个新的Cse1l^flox等位基因。Wnt1-Cre2、Sox2-Cre、Rosa^mTmG和Trp53小鼠来自Jackson实验室，通过特定引物组进行PCR基因分型：

新型Cse1l条件性等位基因的生成与鉴定

为了研究Cse1l在颅面发育中的作用，我们利用CRISPR/CAS9基因编辑技术在Cse1第3外显子两侧插入两个loxP位点，生成了Cse1l^em2Rstot等位基因，以下简称Cse1l^flox。我们还使用了之前生成的Cse1l^em1Rstot空缺等位基因（以下简称Cse1l^CRISPR），该等位基因在氨基酸35处有一个早终止密码子（Blizzard等人，2021年）。这些等位基因的功能得到了验证。

讨论

由于Cse1l^null/null突变体在E5.5阶段就具有致死性（Bera等人，2001年），因此阐明Cse1l在胚胎发育中的关键作用一直很困难。我们之前的工作发现了一个由ENU诱导的变体等位基因Cse1l^anteater，但其表型变化很大，限制了深入的分子和细胞分析（Blizzard等人，2021年）。为了克服这些限制，我们在此报告了一种新型的Cse1l条件性等位基因。利用这一工具，我们

CRediT作者贡献声明

保罗·P·R·伊亚纳尔（Paul P.R. Iyyanar）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，实验设计，数据分析，概念构思。罗尔夫·斯托特曼（Rolf Stottmann）：撰写 – 审稿与编辑，项目监督，资金获取，数据分析，概念构思

未引用的参考文献

Feng等人，2022年。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢斯托特曼实验室团队的意见反馈。感谢辛辛那提儿童医院医学中心的Samantha A. Brugmann博士分享Wnt1-Cre小鼠（Wnt-1/GAL4/Cre-11）。感谢Nicole Constantino在实验室中帮助维护Cse1l小鼠品系。感谢辛辛那提儿童医院转基因和基因组编辑核心团队以及Yueh-Chiang Hu在创建Cse1l^flox品系方面的支持。感谢显微镜中心主任Tatyana Vetter博士的帮助。