基于AM580的高纯度hiPSC来源光感受器前体细胞高效分化及其在视网膜变性中的神经保护作用

《iScience》：Efficient derivation of hiPSC-derived photoreceptor precursor cells and their neuroprotective effects in retinal degeneration

本研究针对视网膜变性疾病缺乏有效治疗手段的难题，开发了利用AM580高效诱导人多能干细胞分化为高纯度光感受器前体细胞的新方法。研究人员通过化学诱导体系在24天内获得纯度>99.9%的CRX+/LHX4+细胞，移植至视网膜变性模型显示其能成熟为表达视蛋白的光感受器，形成突触前结构，并显著保留视网膜外层厚度，为细胞替代疗法治疗视网膜变性提供了新策略。

　　

视网膜变性疾病是一组不可逆的致盲性眼病，全球约有2.85亿患者深受其害。这类疾病包括视网膜色素变性（RP）和年龄相关性黄斑变性（AMD）等，其核心病理机制是光感受器的进行性功能障碍和不可逆的细胞丢失。在疾病晚期，光感受器的耗竭限制了传统基因疗法的效果，因为基因治疗需要残留的光感受器作为转导靶点。面对这一严峻挑战，全球科学家将目光投向了一些创新性治疗策略，如光遗传学、光开关、视网膜假体和光感受器细胞移植等。其中，光感受器移植作为一种再生医学方法，旨在通过补充丢失的光感受器来恢复视网膜环路功能，已成为最具潜力的治疗方向之一。

尽管已有大量研究验证了光感受器移植的安全性和有效性，但 donor 细胞来源、制造可扩展性、安全性和长期功能疗效等方面仍存在关键挑战。特别是如何优化 donor 细胞类型和制造平台，以实现 robust 的细胞存活、宿主-移植体整合和功能恢复，是当前研究的重点。随着二维（2D）和三维（3D）细胞培养技术的发展，光感受器细胞的生产正逐步走向临床应用。

然而，传统的二维培养方法往往存在分化效率低或分化周期长的问题。近期，基于小分子的外胚层分化策略取得了重要突破，这一策略起源于双SMAD抑制技术，通过SB431542（TGF-β受体/ALK5抑制剂）和LDN193189（BMP受体/ALK2/3抑制剂）的协同作用，促进神经外胚层定向分化。这一范式使得无需transwell培养或类器官系统即可重复生成视网膜色素上皮（RPE）和光感受器前体细胞（PPCs）成为可能。

值得注意的是，传统的双SMAD抑制策略通常包含血清成分和视黄酸（RA），存在分化周期长（>70天）和生物危害风险（动物源污染物、过敏性）等缺点。此外，RA的光不稳定性和氧化不稳定性需要血清共同补充，这使临床转化复杂化。

针对上述问题，武汉大学等单位的研究人员在《iScience》上发表了最新研究成果，开发了一种无RA的化学诱导系统，用于从人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效生产PPCs，并证明了其在视网膜变性模型中的治疗效力。

研究人员应用了几个关键技术方法：首先，他们建立了基于AM580的化学成分明确的二维分化体系，通过三阶段诱导（神经诱导、视网膜祖细胞定向、光感受器终末分化）高效生成PPCs。其次，利用流式细胞术、免疫荧光染色、单细胞RNA测序（scRNA-Seq）和批量RNA测序（Bulk RNA-seq）对分化细胞进行了全面表征。此外，研究还涉及了亚视网膜注射（SRI）和玻璃体内注射（IVI）细胞移植技术，并采用光学相干断层扫描（OCT）、免疫组织化学、透射电子显微镜（TEM）、闪光视觉诱发电位（FVEP）、光动力反应（OMR）和明暗箱测试等多种手段，在rd10小鼠和N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）诱导的小鼠视网膜变性模型中，评估了移植细胞的存活、整合、分化、神经保护作用及潜在视觉功能恢复情况。

分化及表征hiPSC来源的PPCs

研究团队设计了一个24天的分层分化方案，使人诱导多能干细胞依次经历神经干细胞（NSC）定向、视网膜祖细胞（RPC）成熟，最终生成PPCs。该方案在时间上比标准3D视网膜类器官分化方案缩短了50%。分化终点（第24天）的流式细胞术分析显示，CRX⁺细胞比例为99.91%，LHX4⁺细胞比例为99.95%，纯度极高。

阶段分辨分子图谱描绘了关键的视网膜发生发育轨迹：从表观遗传学上的Nanog抑制开始，经历Sox2/Nestin共激活介导的神经诱导，进展到Pax6/Chx10共表达驱动的视网膜定向，最终实现标志光感受器终末分化的CRX/RCVRN转录激活。重要的是，在分化终点未观察到穆勒细胞、水平细胞、双极细胞、视网膜神经节细胞或无长突细胞，证实了分化方案具有极高的谱系特异性。

hiPSC-PPCs在小鼠视网膜微环境中的存活与成熟

将hiPSC来源的PPCs移植到5周龄rd10小鼠和8周龄C57小鼠的亚视网膜腔（SRS）后，纵向OCT成像显示，移植后3个月，在C57和rd10受体小鼠的SRS中均持续存在 donor 细胞簇。免疫荧光分析揭示了移植PPCs在三个关键维度的表现： donor 细胞命运决定、免疫微环境动力学以及光感受器特异性功能结构的建立。

研究发现，移植视网膜中胶质细胞和免疫激活极微，表明对异种移植物的炎症性免疫排斥反应不显著。 donor 细胞簇内可检测到视杆细胞特异性标记物RHO和视锥细胞特异性标记物L/M Opsin的表达，证实了PPCs可分化成熟为视杆和视锥细胞。此外，外周蛋白2（PRPH2，一种OS盘结构的关键介导因子）在 donor 细胞顶端的极化定位，提示光转导 machinery 组装的功能启动。

PPCs在MNU诱导的视网膜变性模型中的神经保护作用

为了模拟RP的进展，研究人员给8周龄C57小鼠腹腔注射MNU建立视网膜变性模型。在注射MNU的当天，通过SRI将PPCs移植到模型小鼠的SRS中，以评估PPCs在整个RP病程中的神经保护效果。

组织学检查显示，移植后1个月，MNU处理小鼠的ONL完全变性，而接受PPCs移植的MNU模型小鼠（MNU+cell）则保留了显著的ONL结构。定量分析显示，在移植细胞簇所在的区域（“有移植簇”区域），ONL厚度（43.18 ± 5.06 μm）显著大于无移植簇区域（12.70 ± 1.73 μm），证实了距离依赖的神经保护作用。值得注意的是，尽管无移植簇区域的ONL厚度小于有移植簇区域，但这些区域仍保留了部分保护作用，提示存在间接的旁分泌介导的神经保护。

纵向分析表明，在病理微环境中， donor 细胞存活率和神经保护效果随时间推移而逐渐减弱。 donor 细胞存活数量从1个月时的327 ± 46个，下降到2个月时的34 ± 5个，再到3个月时的12 ± 3个。同时，保留的ONL厚度和连续性也显著下降，反映了神经保护效能随时间和空间的衰减。

变性视网膜SRS中hiPSC-PPCs的光感受器成熟与突触重连

在移植到8周龄MNU模型小鼠体内的hiPSC来源PPCs中，可观察到 robust 的光感受器谱系分化。 donor 细胞表达光转导效应蛋白RCVRN，以及视杆细胞特异性RHO和视锥细胞特异性L/M Opsin，表明变性视网膜微环境支持 donor 细胞的功能成熟。免疫荧光分析还发现，在 donor 细胞簇内存在突触前标记物CtBP2的表达，这些CtBP2⁺点状结构与宿主双极细胞树突紧密相邻，类似于天然光感受器的突触带形态。

在rd10小鼠视网膜中，移植后3个月，尽管观察到穆勒细胞激活等病理反应，但 donor 细胞仍保持代谢活性并表达RHO。同样，在 donor 细胞内部也观察到离散的CtBP2⁺突触前点状结构，与宿主双极细胞树突紧密相邻。然而，在移植的rd10小鼠中，FVEP记录未显示显著改善，行为测试也仅呈现未达到统计学意义的积极趋势。这表明，在晚期变性背景下，尽管形成了突触前样结构，但要实现功能性的、稳健的突触配对和显著的视觉功能恢复仍面临挑战。

研究结论与意义

本研究成功建立了一种无RA的化学诱导系统，用于从hiPSCs高效生产高纯度PPCs，并证明了其在视网膜变性模型中的治疗潜力。在遗传性rd10模型中，移植的PPCs表现出结构成熟并形成突触前特化结构；在急性MNU诱导损伤中，早期PPCs干预显示出神经保护作用，减轻光感受器丢失并保留视网膜结构。

该研究的重要意义在于：首先，所建立的分化方案在效率和时间上优于传统方法，为临床转化提供了更安全、可扩展的细胞来源。其次，研究证实了移植细胞在宿主视网膜微环境中的存活、分化和结构整合能力，特别是在形成突触前特化结构方面取得了进展。第三，研究揭示了神经保护作用的时空动态变化特征，以及移植途径（SRI优于IVI）对疗效的关键影响，为优化治疗策略提供了重要依据。

尽管研究未产生统计学显著的功能恢复，但通过超微结构、电生理和行为学评估相结合的综合分析方法，为评估晚期视网膜变性中的突触整合提供了有价值的参考框架。研究结果强调了未来治疗策略需要结合增强移植细胞存活率和促进功能连接的方法，并定义了最佳干预窗口和微环境调节因子对于临床转化的必要性。这项工作为早期变性阶段的细胞替代疗法奠定了基础，同时指明了实现临床转化仍需克服的挑战和未来研究方向。