神经元NMDA受体通过VEGF-Ca2+信号轴调控斑马鱼大脑血管发育的新机制

《Nature Communications》：NMDA receptors coordinate brain vascular development via neuron-to-endothelial tip cell crosstalk in zebrafish

本研究针对神经活动如何精确调控大脑血管发育这一关键科学问题，通过多学科技术手段，揭示了神经元NMDA受体通过ERK/CaMKIIα通路调控VEGF表达，进而激活内皮尖端细胞全局Ca2+活动促进血管生长的全新机制，为理解神经血管相互作用提供了重要理论依据。

　　

大脑作为人体最精密的器官，其正常功能的维持离不开完善的血液供应系统。在胚胎发育过程中，神经系统和血管系统同时进行着高度协调的构建过程，二者之间存在着密切的相互作用。这种神经血管相互作用（neurovascular interaction）的精确调控对大脑发育至关重要，但其具体分子机制尚不完全清楚。

近年来研究表明，神经活动（neural activity）能够影响大脑血管的发育。生理状态下的神经活动和丰富环境刺激可以促进局部大脑皮层的血管密度和分支增加，而神经回路过度激活则会抑制脑血管发育。然而，神经活动调控脑血管发育的具体分子机制仍有待阐明。N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptors, NMDARs）作为中枢神经系统中主要的一类谷氨酸受体，在神经发育和功能中发挥关键作用。那么，神经元上的NMDAR是否参与调控大脑血管发育？这是本研究旨在解决的核心科学问题。

为了解决这一问题，杜久林教授团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们以斑马鱼为模型，综合运用遗传学、光遗传学、活体成像等多种先进技术，系统研究了神经元NMDAR在脑血管发育中的作用及其机制。

研究主要采用了以下关键技术方法：利用转基因斑马鱼系（Tg(kdrl:eGFP)）进行脑血管网络活体成像；通过TALEN和CRISPR/Cas9技术构建grin1b基因突变斑马鱼系；运用光遗传学（ChrimsonR）和电刺激调控神经活动；开展在体全细胞记录分析NMDA诱导电流；采用激光扫描共聚焦显微镜进行钙成像和NP-EGTA/Ca²⁺解笼锁实验；通过神经元分选和Western blot分析分子表达变化。

Dysfunction of NMDARs impairs the development of the zebrafish brain vasculature

研究人员首先通过药理学方法调控NMDAR活性，发现使用选择性NMDAR拮抗剂MK-801和D-AP5处理斑马鱼幼鱼后，大脑血管发育显著受损，表现为血管密度、总长度、分段数量等参数明显降低。相反，使用NMDAR激动剂NMDA处理则促进脑血管发育。这些结果表明NMDAR激活是正常大脑血管发育所必需的。

为进一步验证这一发现，研究团队通过TALEN技术构建了grin1b基因（哺乳动物GRIN1同源基因）突变斑马鱼系。发现grin1b^+/-幼鱼的大脑血管网络同样出现明显缺陷，而躯干血管发育相对正常。通过吗啉代寡核苷酸（morpholino oligo, MO）敲低grin1b表达也得到一致结果，证实了NMDAR在脑血管发育中的重要作用。

NMDARs expressed on neurons are essential for brain vascular development

NMDAR不仅表达在神经元上，也存在于脑内血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）中。为确定究竟是神经元还是内皮细胞中的NMDAR介导了上述效应，研究人员通过神经元特异性或内皮细胞特异性过表达grin1b点突变体（N598Q）和C末端片段（CT），特异性干扰神经元或内皮细胞中的NMDAR信号。

结果显示，神经元特异性过表达grin1b NQ（破坏通道功能）或grin1b CT（抑制下游信号）均显著损害大脑血管发育，而内皮细胞特异性过表达则无显著影响。此外，在grin1b morphants中神经元特异性过表达grin1b可挽救脑血管缺陷。研究人员还利用Cre-loxP系统构建了神经元特异性grin1b条件性敲除（conditional knockout, CKO）斑马鱼系，进一步证实神经元NMDAR对大脑血管正常发育至关重要。

NMDARs are required for neural activity-induced enhancement of brain vascular development

考虑到大脑在正常状态下（尤其是发育期间）存在高水平自发性神经活动，研究人员进一步探究NMDAR是否参与神经活动对脑血管发育的调控。通过光遗传学刺激（optogenetic stimulation）增强神经活动，发现可显著促进大脑血管形成，而这种促进作用可被MK-801完全抑制。

类似地，全电场电刺激（whole-field electrical stimulation）和移动光条刺激（moving bar stimulation）也都能促进脑血管发育，且这些效应均依赖于NMDAR激活。这些结果充分证明NMDAR是神经活动诱导的脑血管发育增强所必需的。

NMDARs mediate neural activity-induced promotion of ETC growth via increasing ETC Ca²⁺activity

在血管生成过程中，位于血管生长前沿的内皮尖端细胞（endothelial tip cells, ETCs）通过伸出丝状伪足（filopodia）引导血管芽生（sprouting angiogenesis）。研究人员通过活体成像发现，神经元grin1b CKO幼鱼的大脑ETCs在数量、生长速率、丝状伪足数量和长度等方面均显著降低。

通过光遗传学或移动光条刺激增强神经活动可促进ETC生长，且这种促进作用依赖于NMDAR激活。研究还发现，黑暗饲养（dark rearing）导致ETC生长速率显著降低，表明与饲养光照相关的神经活动在ETC生长中发挥作用。

钙离子（Ca²⁺）信号在细胞迁移和血管生成中起重要作用。研究人员通过405纳米激光脉冲解笼锁NP-EGTA/Ca²⁺复合物诱导ETC全局Ca²⁺活动，发现可显著促进ETC生长。进一步分析显示，ETC全局Ca²⁺瞬变频率与其生长速率呈正相关。局部光遗传学刺激可增加附近ETCs的全局Ca²⁺瞬变数量，且该效应可被MK-801抑制。

Neuronal NMDARs regulate VEGF expression via ERK/CaMKIIα pathways

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是血管发育的关键调节因子。研究人员发现，grin1b morphants中神经元内vegfaa和vegfab的mRNA水平显著降低，神经元特异性过表达grin1b CT的幼鱼中VEGF-A蛋白水平也明显下降，表明神经元VEGF是NMDAR的下游信号分子。

进一步机制研究表明，抑制ERK活性（使用PD98059）或CaMKIIα活性（使用KN93）可显著降低VEGF-A表达。结合神经元NMDAR功能障碍幼鱼中pERK和pCaMKIIα水平降低的结果，表明神经元NMDAR通过ERK/CaMKIIα通路调控VEGF表达。

NMDARs mediate neural activity-induced ETC Ca²⁺activities via VEGF signaling

为验证VEGF是否能诱导ETC Ca²⁺活动，研究人员通过微管局部喷射外源VEGF蛋白，发现可成功诱发ETC全局Ca²⁺活动。更重要的是，光遗传学刺激诱导的和自发的ETC全局Ca²⁺瞬变均可被VEGFR2选择性抑制剂Ki8751抑制。

本研究系统揭示了NMDAR在调控大脑血管发育中的新功能。具体而言，神经活动激活的神经元NMDAR通过ERK/CaMKIIα通路促进神经元VEGF表达，释放的VEGF进而增加ETC全局Ca²⁺活动及其相关的生长能力，最终导致大脑血管发育增强。

这一发现不仅扩展了NMDAR的功能范畴，也增进了我们对发育过程中神经与血管系统相互作用的机制理解。研究建立的"神经活动-NMDAR激活-VEGF表达-ETC Ca²⁺活动-血管生长"信号轴，为理解神经血管相互作用提供了全新视角，对相关发育性疾病和脑血管病变的研究具有重要启示意义。

该研究的创新性在于首次将神经元NMDAR、VEGF信号和ETC Ca²⁺活动有机联系起来，揭示了神经活动调控血管发育的完整信号通路。此外，研究还发现大脑血管发育早期阶段NMDAR功能障碍会导致血管成熟延迟，表现为血管半径减小，而随着发育进行，血管半径可恢复正常，但早期生长缺陷导致血管分支和网络长度减少，这提示NMDAR在血管生成的不同阶段可能发挥不同作用。

研究结果对理解神经血管耦合（neurovascular coupling）的发育基础具有重要意义，为探索相关神经系统疾病和脑血管疾病的发病机制提供了新思路。未来研究可进一步探究不同神经细胞类型特异性NMDAR活动对血管模式的精细调控，以及这一信号通路在病理条件下的变化，为相关疾病的治疗策略开发提供理论依据。