血小板膜工程化hiPSC来源小细胞外囊泡靶向修复纤维化窦房结：一种治疗窦房结功能障碍的无细胞纳米治疗新策略

《Nature Communications》：Platelet-bioengineered hiPSC-sEVs achieve targeted repair of fibrotic sinoatrial node in preclinical SND models

本研究针对窦房结功能障碍（SND）现有疗法无法逆转纤维化及起搏功能丧失的临床难题，开发了血小板膜融合的人诱导多能干细胞来源小细胞外囊泡（PM@i-sEVs）。该工程化囊泡通过GPVI-胶原靶向和CD47介导的免疫逃逸，在SND大鼠模型中实现窦房结特异性富集（积累量提升3.1倍），使纤维化面积减少63%，并显著恢复心率和内在起搏功能。该研究为SND提供了首个兼具靶向性和再生功能的无细胞治疗平台，为心血管纤维化疾病的精准治疗开辟新途径。

　　

随着人口老龄化加剧，窦房结功能障碍（Sinus Node Dysfunction, SND）已成为临床最常见的心律失常之一。这种疾病以窦房结（Sinoatrial Node, SAN）纤维化、起搏细胞丢失为特征，导致心动过缓、晕厥甚至心力衰竭，目前主要依赖永久性心脏起搏器植入。然而，起搏器仅能缓解症状，无法逆转疾病进展，患者仍需面临装置相关并发症的终身风险。更遗憾的是，现有基因疗法（如TBX18过表达）或细胞移植等再生策略，因存在致瘤性、细胞存活率低、靶向性差等问题，临床转化举步维艰。

在这一背景下，人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）来源的小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）因其天然携带修复性生物活性分子（如miRNA），且免疫原性低，被视为极具潜力的无细胞治疗工具。但天然sEVs缺乏靶向性，易被快速清除，难以精准作用于窦房结这类微小病灶区域。如何让sEVs“聪明”地找到病变部位，并高效释放治疗性 cargo，成为突破疗效瓶颈的关键。

发表于《Nature Communications》的这项研究，巧妙利用血小板膜天然的损伤靶向特性，构建了血小板膜融合的hiPSC-sEVs（PM@i-sEVs），成功实现了对纤维化窦房结的精准修复。研究团队通过将血小板膜囊泡（Platelet Membrane Vesicles, PMVs）与hiPSC-sEVs（i-sEVs）按3:1质量比融合，使PM@i-sEVs同时携带了血小板膜的胶原靶向蛋白（GPVI、CD42b）和免疫逃避蛋白（CD47），以及i-sEVs固有的修复性miRNA。

为验证其靶向能力，研究团队建立了稳定的大鼠SND模型（SH-IR法），结合氢氧化钠点压渗透和缺血再灌注损伤，模拟人类SND的纤维化与电生理异常。体内外实验表明，PM@i-sEVs可通过GPVI-胶原结合机制，在损伤窦房结区域富集量较未修饰i-sEVs提高3.1倍，且肝脏滞留减少46%。

治疗28天后，PM@i-sEVs组心率显著恢复（378.6±15.8 bpm vs 模型组303.0±15.5 bpm），窦房结恢复时间（ADSNRT）缩短，纤维化面积减少63%。机制上，PM@i-sEVs通过上调HCN4/SCN5A离子通道和连接蛋白（Cx43/Cx45），恢复起搏细胞电活动；同时抑制成纤维细胞活化（降低α-SMA、COL III表达），并保护心肌细胞线粒体功能，减少氧化应激损伤。

miRNA测序进一步揭示，PM@i-sEVs中miR-223-3p、miR-328-3p、let-7家族等修复相关miRNA显著富集，其靶基因富集于离子转运、TGF-β信号通路、细胞凋亡等与SND密切相关的通路。

关键技术方法

研究采用超速离心联合尺寸排阻色谱法（SEC）从hiPSC培养上清中提取高纯度i-sEVs；通过冻融-挤出法制备血小板膜囊泡（PMVs），并与i-sEVs按优化比例融合获得PM@i-sEVs；利用大鼠SND模型（SH-IR法）进行在体功能评价；通过miRNA测序、免疫印迹、免疫荧光、透射电镜等技术分析囊泡特性、靶向机制及治疗效应。

研究结果

提取和表征i-sEV

从U2-hiPS细胞培养上清中分离的i-sEVs经透射电镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）验证为典型脂质双分子层结构，粒径约100 nm，表达CD9、CD63、TSG101等sEV标志蛋白，且AGO2阴性，符合国际细胞外囊泡学会（ISEV）指南标准。

制备和表征PM@i-sEV

PM@i-sEVs粒径约206 nm，zeta电位-13 mV，蛋白印迹证实其同时表达血小板膜蛋白（CD42b、GPVI、CD47）和sEV标志物（Alix、CD9）。FRET实验显示PMV与i-sEV以3:1比例融合效率最高。

细胞摄取和内化

PM@i-sEVs主要通过动力蛋白依赖性内吞途径进入细胞，且能在24小时内逃离内吞-溶酶体系统，实现胞质内药物释放。

体内外靶向效应

在SND大鼠模型中，DiR标记的PM@i-sEVs在窦房结区域荧光信号强度较i-sEVs组提高6.6倍。体外胶原结合实验表明，其靶向依赖GPVI-胶原相互作用，可被GPVI阻断抗体抑制。

PM@i-sEV和i-sEV的miRNA测序

PCA分析显示PM@i-sEVs与i-sEVs的miRNA谱显著分离。PM@i-sEVs中miR-328-3p等修复相关miRNA上调，其靶基因显著富集于离子运输、心肌传导、TGF-β信号通路等。

大鼠SND模型构建及PM@i-sEV治疗效果评价

SH-IR法成功建立稳定SND模型，模型组心率下降30%以上，并出现窦性停搏、交界性逸搏等典型心律失常。PM@i-sEVs治疗28天后，心率变异性（HRV）参数改善，Poincaré图由散点状恢复为彗星状，提示心脏自主神经调节功能恢复。

PM@i-sEV治疗减少窦房结纤维化并保护起搏细胞活性

组织学分析显示，PM@i-sEVs组胶原沉积显著减少，HCN4⁺起搏细胞密度增加，RyR（兰尼碱受体）和连接蛋白Cx45表达上调。蛋白印迹证实纤维化标志物（COL I、α-SMA、CTGF）下调，而电传导关键蛋白SCN5A和Cx43表达恢复。

PM@i-sEV和i-sEV的体外抗纤维化和细胞保护作用

在TGF-β1诱导的成纤维细胞活化模型中，PM@i-sEVs抑制α-SMA表达和细胞迁移；在H₂O₂诱导的氧化应激模型中，其降低ROS生成，维持线粒体膜电位，提升ATP水平，保护线粒体超微结构。miR-328抑制剂可逆转PM@i-sEVs的抗纤维化和线粒体保护作用，提示miR-328是其关键效应分子。

讨论与结论

本研究首次将血小板膜工程化策略应用于hiPSC-sEVs，解决了SND治疗中的靶向递送难题。PM@i-sEVs凭借仿生设计，同时实现损伤部位特异性富集、免疫逃逸和高效胞内递送，在逆转纤维化、恢复电生理功能方面展现出显著优势。该平台不仅为SND提供了无细胞治疗新策略，其“精准导航”设计理念亦可拓展至其他纤维化性疾病治疗中。未来研究需进一步优化sEVs亚型异质性控制策略，并探索大型动物模型中的长效安全性，推动临床转化。