氯离子动态平衡调控中脑GABA能网络协同活动驱动奖赏学习的新机制

《Nature Communications》：Dynamic changes in chloride homeostasis coordinate midbrain inhibitory network activity during reward learning

本研究针对奖赏学习过程中中脑多巴胺（DA）神经元上游调控机制不明的关键问题，通过行为学、电生理学和分子生物学技术，发现腹侧被盖区（VTA）GABA能神经元在奖赏学习获得阶段通过下调钾-氯协同转运蛋白2（KCC2）功能，破坏氯离子稳态，增强GABA能网络同步化活动，进而放大下游DA神经元的簇状放电，促进线索-奖赏关联形成。该成果揭示了KCC2介导的氯离子动态平衡是奖赏学习的关键分子开关，为理解成瘾等精神疾病中学习机制异常提供了新视角。

　　

在日常生活中，我们能够将环境中的线索（如铃声）与随之而来的奖励（如食物）联系起来，这种称为联想奖赏学习的能力是生存的基础。中脑多巴胺（DA）神经元在此过程中扮演关键角色，它们在学习初期对奖励本身作出反应，而经过反复配对后，其活动会转移到预测奖励的线索上。然而，驱动多巴胺神经元反应发生这种变化的上游神经机制，尤其是其主要的抑制性输入——GABA能神经元在学习过程中如何变化，尚不清晰。

传统观点认为，GABA主要通过GABA_A受体介导的氯离子内流引发超极化抑制。但近年研究发现，在某些病理状态（如应激、药物成瘾）下，GABA能神经元内的氯离子 extrusion 泵KCC2功能下调，导致细胞内氯离子积聚，GABA_A受体信号反而可能去极化甚至兴奋神经元。这种氯离子稳态的紊乱是否是病理状态特有的，还是在生理性学习过程中也会发生并发挥重要作用，是一个悬而未决的问题。

针对这一空白，发表在《Nature Communications》上的这项研究揭示，在自然奖赏学习过程中，VTA内GABA能神经元的氯离子稳态会发生短暂的、动态的调控，这种变化通过增强GABA能神经元的同步化活动，精确地塑造下游多巴胺信号，从而驱动新的奖赏关联的形成。

研究人员综合运用了行为学（帕夫洛夫条件反射）、在体（光纤记录、在体多通道电生理记录）和离体（膜片钳电生理）神经活动记录、光遗传学操控、化学遗传学操控、免疫印迹、免疫组化以及基于深度学习的行为分析等关键技术方法。实验对象主要为GAD-Cre和TH-Cre转基因大鼠，允许对GABA能或多巴胺能神经元进行细胞类型特异性操作和记录。

学习依赖性VTA GABA神经元中KCC2的下调

为了捕捉在学习过程中被激活的特定GABA能神经元，研究者在GAD-Cre大鼠的VTA注射了Cre依赖的钙指示剂CaMPARI2和蓝色荧光蛋白（BFP）。在自由活动的大鼠进行线索-奖赏配对学习时，在特定阶段用紫外光照射，将高钙浓度的神经元标记为红色。通过膜片钳记录发现，仅在学习的获得期，这些被激活的VTA GABA神经元表现出GABA_A受体电流反转电位（E_GABA）的显著去极化，表明其细胞内氯离子浓度升高。这一变化伴随着KCC2蛋白第940位丝氨酸（S940）磷酸化水平的特异性降低（即KCC2功能抑制），而总KCC2和氯离子导入泵NKCC1的表达未变。在未配对对照组或学习平台期均未观察到此种变化，且VTA多巴胺神经元的E_GABA保持稳定。这表明奖赏学习特异性地、短暂地破坏了VTA GABA神经元的氯离子稳态。

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学习介导的KCC2下调影响投射至NAc外侧壳的DA神经元

VTA多巴胺神经元投射到伏隔核（NAc）不同亚区，其中投射至NAc外侧壳的DA神经元对奖赏相关线索的反应在学习过程中尤为突出。研究人员发现，在学习的获得期，这些特定的DA神经元接收到的自发抑制性突触后电流（sIPSCs）中，间隔小于10毫秒的连续事件比例显著增加，表明GABA释放的同步性增强。使用KCC2增强剂CLP290处理可逆转此现象，而KCC2抑制剂VU0463271在幼稚大鼠中可模拟该效应。增强GABA_A受体功能的药物地西泮在获得期能引起sIPSC频率的显著增加，此效应也可被CLP290阻断。这些变化在投射至NAc内侧壳或核心的DA神经元中并未出现，凸显了KCC2调控的环路特异性。

VTA GABA神经元和KCC2下调有助于奖赏学习

行为学实验证实，在学习获得期用光遗传学抑制VTA GABA神经元活动，或通过药理学（CLP290）增强KCC2功能，都会延缓或阻断线索-奖赏关联的形成。相反，在学习前用shRNA敲低VTA GABA神经元中的KCC2，则加速了学习进程。而在学习平台期给予CLP290则不影响行为表现。这表明KCC2功能下调是奖赏学习获得所必需的。

VTA GABA神经元在学习获得期表现出增强的同步化活动

在体多通道记录显示，在学习的获得期，VTA内GABA神经元之间在毫秒时间尺度上的同步化放电活动显著增加。药理学上，VTA内注射CLP290会降低这种同步化，而注射VU0463271则会增强幼稚大鼠中GABA神经元的同步活动。这表明KCC2功能状态双向调控着VTA GABA网络的同步化。

KCC2功能改变增强VTA和NAc中的DA信号

对VTA DA神经元在体记录发现，在获得期，由线索和奖赏诱发簇状放电中的动作电位数量显著增加，而簇内放电频率无变化。VTA内注射CLP290或光抑制GABA神经元活动，均能减少这种簇内放电的脉冲数。同时，利用光纤光度法测量NAc外侧壳的多巴胺释放发现，获得期线索诱发的DA信号增强，而此增强可被VTA内注射CLP290所削弱。

光遗传学同步化VTA GABA神经元增强体外和体内刺激诱发的簇状放电

为了验证同步化的GABA输入是否能直接增强DA神经元的簇状放电，研究者在脑片和麻醉大鼠中进行了实验。在脑片中，用离子电泳给予谷氨酸诱发VTA DA神经元簇状放电的同时，用10Hz光刺激同步化邻近的ChR2表达的GABA神经元，可增加簇状放电中的脉冲数。在麻醉大鼠中，电刺激脚桥被盖核（PPTg）诱发DA神经元簇状放电的同时，进行10Hz光遗传学同步化VTA GABA神经元，同样能增强簇状放电。这直接证明了GABA能网络的同步化活动可以放大DA神经元的相位性爆发信号。

结论与意义

本研究揭示了奖赏学习过程中一个此前未知的关键机制：VTA GABA神经元中KCC2功能的短暂下调，导致氯离子稳态改变和GABA能网络同步化活动增强，进而强化了下游DA通路对奖赏相关线索的反应，促进了线索-奖赏关联的形成。这不仅将氯离子稳态的动态调节与生理性学习过程直接联系起来，还提出了神经同步化的一种新颖分子机制（KCC2调控）。更重要的是，该研究提示，在成瘾等病理状态下观察到的KCC2功能紊乱，可能是“劫持”了正常学习所依赖的神经可塑性机制。这为理解相关精神疾病的病理生理学提供了新的框架，并指出KCC2可能成为干预病理性奖赏学习的新靶点。