结构揭秘：红藻氨酸受体脱敏过程中的构象动力学与离子通道调控机制

《Nature Communications》：Structural insights into kainate receptor desensitization

本研究针对红藻氨酸受体（Kainate Receptors, KARs）脱敏过程中构象变化的分子机制这一长期未解难题，通过冷冻电镜技术解析了GluK2受体在非活性、浅层脱敏及深层脱敏等多种状态下的高分辨率结构。研究发现，KARs通过LBD（Ligand-Binding Domain）的大幅度平面旋转实现离子通道的完全闭合，而工程化二硫键稳定下的浅层脱敏态仍保留离子渗透性。该研究不仅揭示了KARs区别于AMPA受体（AMPARs）的独特脱敏路径，还为靶向KARs的神经系统疾病治疗策略提供了结构基础。

　　

在哺乳动物大脑中，谷氨酸作为主要的兴奋性神经递质，通过激活离子型谷氨酸受体（iGluRs）介导快速的突触传递。红藻氨酸受体（KARs）作为iGluR家族的重要成员，不仅参与突触后兴奋信号的传导，还能通过突触前和突触外作用调节神经递质释放，从而影响神经环路的可塑性。然而，与家族中的其他明星成员如AMPA受体（AMPARs）和NMDA受体（NMDARs）相比，KARs显得格外“特立独行”：它们在与激动剂结合后，会迅速进入一种称为“脱敏”的失活状态，且从该状态恢复的速度极其缓慢，比AMPARs慢数十倍。这种独特的动力学特性暗示其背后可能隐藏着与众不同的分子开关。

长期以来，一个核心问题困扰着神经科学领域的研究者：为什么KARs在脱敏过程中需要经历如此巨大的构象变化？尽管此前的研究已通过冷冻电镜技术捕捉到KARs在完全脱敏状态下的结构，显示其配体结合域（LBD）呈现出近乎四重对称的“完全解离”构象，但这仅仅是故事的高潮部分。从活跃的“开放”状态到完全失活的“脱敏”状态，其间经历了怎样的动态演变？这些构象变化如何精确控制离子通道的开闭？更重要的是，这种独特的脱敏机制对KARs在生理和病理条件下的功能有何意义？为了回答这些问题，由Changping Zhou、Guadalupe Segura-Covarrubias和Nami Tajima领导的研究团队展开了一项深入的结构与功能研究，其成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员综合运用了分子生物学、蛋白质生化、冷冻电镜单颗粒分析技术及膜片钳电生理记录等多种技术手段。他们首先通过同源建模和结构分析，在GluK2受体的LBD二聚体界面设计了双半胱氨酸突变体（K676C/N802C），旨在利用二硫键“锁定”受体可能存在的中间构象。随后，在HEK293S GnTI细胞中表达并纯化了该突变体蛋白，分别在激动剂（谷氨酸）和正构调节剂BPAM344存在或不存在的条件下制备样品，通过冷冻电镜解析了受体在非活性、浅层脱敏、中间状态和深层脱敏等多种状态下的高分辨率结构（最高分辨率达3.4 ?）。在功能验证方面，研究团队利用全细胞膜片钳技术系统表征了突变体的脱敏程度、恢复动力学以及离子渗透性，并通过非平稳波动分析和稳态波动分析评估了其单通道电导特性。此外，还利用Western blot验证了二硫键的形成，并使用还原剂DTT（二硫苏糖醇）进行可逆性实验，以确认观察到的功能现象确实由二硫键交联引起。

研究结果

利用二硫键交联捕获GluK2的非脱敏状态

为了探究KARs从活跃到脱敏的构象转变路径，研究人员首先设计并构建了GluK2 K676C/N802C双半胱氨酸突变体。电生理记录显示，该突变体在响应谷氨酸时，表现出显著减弱的脱敏程度（仅81%脱敏，而野生型几乎完全脱敏）和增大的稳态电流。当加入正构调节剂BPAM344后，突变体的脱敏程度进一步降低至25%，稳态电流振幅增强约4.7倍，表明其被稳定在一个“非脱敏”状态。

GluK2 K676C/N802C呈现多种构象

通过冷冻电镜分析，研究团队成功解析了突变体在谷氨酸和BPAM344存在下的六种主要三维结构类别，以及在仅含谷氨酸条件下的四种类别。这些结构涵盖了非活性状态、浅层脱敏状态、中间状态和三种不同的深层脱敏状态。其中，非活性状态的结构显示，BPAM344分子结合在LBD的D1-D1界面，同时二硫键（K676C-N802C）将LBD二聚体“锁定”在一起，使胞外域呈现出与开放/活跃状态相似的二重对称排列，但离子通道孔却保持关闭。

浅层脱敏状态模拟了AMPAR样的典型脱敏构象

在缺乏BPAM344的浅层脱敏状态结构中，LBD的D1-D1界面发生解离（这是iGluR脱敏的标志），但二硫键的存在阻止了LBD二聚体的完全解离，使其维持在一个二重对称的“二聚体之二聚体”构象。该构象与AMPARs的脱敏状态非常相似：D1结构域发生约25°的向内翻转，而D2结构域则保持紧密关联。

LBD的大幅度平面旋转是实现离子通道完全闭合的关键

对离子通道孔道的分析揭示了不同状态下的关键差异。非活性状态的通道孔在A656/E662位置（位于孔道上部）出现扭结，呈现部分扩张。浅层脱敏状态的通道孔在T660/M664位置形成收缩，但收缩程度不如深层脱敏状态彻底。而在所有三种深层脱敏状态中，由于LBD（尤其是BD亚基）发生了大幅度的平面旋转（>110°），这种旋转通过LBD-TM3连接肽传递，导致孔道顶部的M664残基向内位移，形成了一个额外的“盖子”，从而实现了通道孔的完全、紧密闭合。这种由LBD旋转驱动的孔道顶部封堵机制，是KARs所特有的，在主要的AMPARs和NMDARs中并未观察到。

功能验证：浅层脱敏态受体仍具有离子渗透性

电生理功能实验证实，二硫键交联的突变体其脱敏恢复速度（平均τ约440 ms）远快于野生型（约1150 ms），更接近于AMPARs的恢复动力学。使用还原剂DTT破坏二硫键后，突变体的恢复动力学恢复至与野生型相似的水平，证明二硫键是产生该表型的原因。更重要的是，稳态波动分析表明，处于脱敏状态的交联突变体仍然具有离子导电性，其单通道电导约为10 pS，低于野生型GluK2在激活状态下的电导（约23 pS）。BPAM344处理增加了开放通道的数量，但并未改变其单通道电导值。这表明，被“锁定”在浅层脱敏状态的KARs形成了一种“渗漏”的脱敏通道，这与完全封闭的深层脱敏态有本质区别。

研究结论与意义

本研究通过精巧的分子设计和高分辨率的冷冻电镜结构解析，首次揭示了KARs在脱敏过程中一系列连续的构象状态。研究结果表明，KARs的脱敏是一个多步骤的构象重排过程：从活跃状态出发，受体可以进入一种由二硫键稳定的、类似于AMPARs的浅层脱敏中间态，该状态的离子通道并未完全闭合，仍允许离子渗透；而要达到完全且稳定的非导电性深层脱敏状态，则必须依赖LBD结构域大幅度、独特的平面旋转运动，这种运动最终通过扭曲LBD-TM3连接肽，在离子通道的顶部形成一个由M664等残基构成的“盖子”，从而实现通道的紧密关闭。

这一发现具有多重重要意义。首先，它从结构上解释了为何KARs的脱敏动力学如此独特且恢复缓慢——因为其通往完全脱敏态的路径需要克服更高的能垒，经历更剧烈的构象变化。其次，研究揭示了KARs功能多样性的结构基础，浅层脱敏态的存在提示在某些条件下（如与特定辅助亚基结合或发生翻译后修饰时），KARs可能表现出不同于经典深层脱敏的电生理特性。最后，该研究为理解KARs在神经系统疾病（如癫痫、缺血性脑损伤）中的作用提供了新视角。在这些病理状态下，细胞外离子浓度和pH值的剧烈变化可能影响KARs的脱敏环（desensitization ring）稳定性或LBD的旋转自由度，从而改变受体的脱敏程度和恢复速度，最终影响神经元的兴奋性与存活。针对KARs脱敏过程关键构象状态的特异性调控，有望成为治疗相关神经系统疾病的新策略。