个性化CRISPR敲入细胞因子基因疗法重塑肿瘤微环境并增强实体瘤CAR-T细胞治疗

《Nature Communications》：Personalized CRISPR knock-in cytokine gene therapy to remodel the tumor microenvironment and enhance CAR T cell therapy in solid tumors

语 为解决实体瘤免疫抑制微环境(TME)阻碍CAR-T细胞疗效的难题，研究人员开发了CancerPAM多组学靶点筛选平台，通过CRISPR-Cas9将CXCL10、CXCL11、IFNG等细胞因子精准敲入肿瘤基因组，实现局部TME重塑。实验证实该策略可显著增强CAR-T细胞浸润与杀伤效能，并在人源化CD34+HuNOG小鼠模型中延长肿瘤控制时间，为个性化免疫联合疗法提供了新范式。

　　

论文解读

实体瘤治疗领域长期面临一个关键瓶颈：即使拥有精准靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞，免疫抑制性肿瘤微环境（TME）仍会像“铜墙铁壁”般阻碍免疫细胞浸润与功能发挥。以神经母细胞瘤为例，其TME中干扰素信号通路被抑制，T细胞趋化因子（如CXCL10）表达缺失，导致CAR-T细胞难以穿透肿瘤基质并清除癌细胞。这种免疫排斥现象在高风险MYCN扩增型神经母细胞瘤中尤为突出，成为影响患者生存率的核心因素之一。

为破解这一难题，Michael Launspach团队在《Nature Communications》发表的研究提出了一种创新策略：通过肿瘤内部表达免疫激活因子，从源头改造TME。该研究的核心突破在于开发了CancerPAM——一个整合全基因组/外显子组测序（WGS/WES）与多组学数据的自动化生物信息学管道，能够精准识别患者特异性的CRISPR-Cas9敲入靶点。

关键技术方法

研究团队首先通过CancerPAM分析54例神经母细胞瘤患者样本及14个细胞系数据，筛选出由单核苷酸变异（SNV）或结构变异/染色体外DNA（ecDNA）断裂点产生的新型PAM序列。利用核糖核蛋白（RNP）电转递送CRISPR系统，将包含EF1α启动子与Q8报告基因的CXCL10、CXCL11、IFNG表达框通过同源定向修复（HDR）敲入靶位点。功能验证涵盖体外Transwell迁移实验、3D生物打印肿瘤模型、免疫缺陷NOG小鼠及人源化CD34⁺HuNOG小鼠模型，通过流式细胞术、数字PCR（dPCR）和活体成像（BLI）评估疗效。

研究结果

1. CancerPAM管道精准定位肿瘤特异性靶点

通过对神经母细胞瘤基因组数据的扫描，CancerPAM在患者样本中平均鉴定出130个转录组范围内的肿瘤特异性PAM位点，其中SNV衍生位点复发率仅1.4%，凸显高度个体化特征。管道通过加权算法整合CFD/MIT特异性评分、Doench/Moreno切割效率评分、基因依赖性及表达量等参数，排名前3的PAM位点特异性评分（CFD>90，MIT>80）与肿瘤总PAM数量呈正相关（p<0.0001），为安全高效的基因编辑提供数据支撑。

2. CRISPR敲入实现位点特异性细胞因子表达

在SK-N-BE2c和SK-N-AS细胞系中，针对IGSF9B、RPLPO等Top-ranked PAM位点的敲入效率达28%-65%，且仅在与PAM突变匹配的细胞中发生。数字PCR验证CXCL10/CXCL11敲入拷贝数达15-25/100细胞，而IFNG因潜在毒性整合率较低。在原发性T细胞中，高排名PAM位点（如CHD1、RBM12）的脱靶敲入率趋近于零，证实CancerPAM排名的安全性预测价值。

3. 肿瘤源性细胞因子增强CAR-T细胞功能

表达CXCL10/CXCL11的肿瘤细胞条件培养基使CAR-T细胞迁移率提升3倍（p<0.01）。在3D生物打印模型中，CXCL10组CAR-T细胞浸润比例提高至21.5%（对照组仅6.1%），且内皮层穿透能力显著增强。IFNG敲入则通过上调肿瘤细胞MHC-I与PD-L1表达，抑制M2型巨噬细胞极化，协同增强CAR-T细胞杀伤活性。

4. 体内实验验证治疗潜力

在免疫缺陷NOG小鼠模型中，CXCL10表达组在CAR-T细胞注射第4天即出现更强的肿瘤局部BLI信号（SK-N-AS组+221%，SK-N-BE2c组+132%），且L1CAM高表达肿瘤的完全缓解率提升至42%。更关键的是，在人源化HuNOG模型中，CXCL10表达使事件无生存期延长至49天（对照组21天，HR=4.7），肿瘤内hCD45⁺免疫细胞与CAR-T细胞浸润显著增加（p<0.05），证实该策略在人类免疫环境下的有效性。

结论与展望

本研究通过CancerPAM引导的个性化CRISPR敲入技术，实现了肿瘤特异性细胞因子的原位表达，成功将“免疫冷肿瘤”转化为“免疫热肿瘤”。该策略突破了传统全身给药的毒性与靶向性局限，为CAR-T细胞疗法、免疫检查点抑制剂等提供了协同增强平台。尽管临床转化仍面临体内递送效率挑战，但结合脂质纳米粒（LNP）或进化腺相关病毒（AAV）等新兴递送系统，这一“肿瘤内免疫工程”范式有望拓展至多种实体瘤治疗，推动精准癌症免疫治疗进入新阶段。