化学修饰CRISPR-Cas9实现单个G-四链体与i-基序靶向，揭示配体依赖性转录调控新机制

《Nature Communications》：Chemically modified CRISPR-Cas9 enables targeting of individual G-quadruplex and i-motif structures, revealing ligand-dependent transcriptional perturbation

本研究针对G-四链体(G4)和i-基序(iM)靶向缺乏选择性的难题，开发了ATENA平台，通过将dCas9-Halo与G4/iM配体共价结合，实现了对单个DNA二级结构的精准靶向。研究发现c-MYC启动子区G4稳定化导致P1特异性转录抑制，而iM靶向则激活转录，且不同配体可产生截然相反的转录效应。该技术为精确解析DNA二级结构功能提供了全新工具，对靶向药物开发具有重要意义。

　　

在人类基因组中，除了经典的双螺旋结构，还存在多种非典型DNA二级结构，其中G-四链体(G-quadruplex, G4)和i-基序(i-motif, iM)因其在基因调控中的潜在作用而备受关注。G4是由鸟嘌呤富集序列通过Hoogsteen氢键形成的四链结构，而iM则是由胞嘧啶富集序列形成的互补结构。大量研究表明，这些结构尤其富集于基因启动子区，特别是与癌症发生发展密切相关的原癌基因（如c-MYC、KRAS等）启动子区，提示它们可能在转录调控中扮演重要角色。

然而，尽管科研人员合成了众多能够与G4或iM结合的小分子配体，但这些配体通常缺乏区分不同基因组位点上相似结构的能力，即缺乏“ inter-G4 selectivity”（G4间选择性）。这种选择性缺失导致在使用配体时难以区分其效应是源于对特定目标结构的直接作用，还是全局性稳定多种类似结构所引发的间接效应。例如，长期以来被认为通过靶向c-MYC启动子区G4（MYC-G4）来抑制c-MYC表达的某些配体，其后有研究指出其抑制作用可能是全局G4稳定化的结果，而非特异性靶向MYC-G4。此外，基因组学研究普遍发现G4的形成与基因活跃转录正相关，但这与多数G4配体导致转录抑制的现象相悖。这些矛盾凸显了开发能够精确靶向单个G4或iM结构工具的迫切性。

为了解决这一关键问题，来自帝国理工学院Marco Di Antonio教授团队的研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种名为ATENA（Approach to Target Exact Nucleic Acid alternative structures）的新型技术平台。该平台的核心思想是利用CRISPR-dCas9系统的靶向特异性，将已知的G4或iM配体通过化学方法共价连接在失活Cas9（dCas9）蛋白上，从而实现对活细胞中单个DNA二级结构的精准定位和调控。

研究团队主要运用了几项关键技术方法：首先，他们合成了系列带有氯烷烃（chloroalkane）修饰的G4配体（如PyPDS、PhenDC3的衍生物Cl-PyPDS_n、Cl-PhenDC3_n）和iM配体肽（Pep-RVS的衍生物Cl-pep-RVS_n），并通过FRET（荧光共振能量转移）熔解实验等体外生化手段验证了这些修饰配体保持了对目标结构的结合与稳定能力。其次，他们利用HaloTag技术，将上述氯烷烃修饰的配体与dCas9-Halo融合蛋白在细胞内进行共价连接，并通过竞争性氯烷烃渗透实验（CAPA）定量评估了连接效率。再者，他们设计了针对特定基因组位点（如c-MYC、PVT1、HMGN1、IL17RA基因启动子区的G4或iM）的单向导RNA（sgRNA），引导dCas9-配体复合物靶向目标。最后，他们通过RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应）、mRNA-seq（转录组测序）以及基于BG4抗体（一种G4特异性抗体）的CUT&Tag-qPCR等技术，在MCF7乳腺癌细胞（研究使用了稳定表达dCas9-Halo的MCF7细胞系）中分析了靶向特定结构后对基因表达和蛋白结合的影响。

化学标记CRISPR-Cas9蛋白以实现选择性G4靶向

研究人员首先合成了两种经典G4配体PyPDS和PhenDC3的氯烷烃修饰类似物（Cl-PyPDS_n和Cl-PhenDC3_n），并证实它们仍能有效稳定G4结构。通过体外竞争实验，他们证明这些修饰配体可以高效且共价地结合到纯化的dCas9-Halo蛋白上。接着，他们利用一个包含c-KIT2 G4序列的双荧光标记DNA模板进行FRET实验，系统优化了使配体能够有效接触目标G4的关键参数，包括连接配体与dCas9的PEG连接子长度以及sgRNA引导dCas9结合的位置与G4之间的距离。结果表明，使用PEG2连接子（Cl-PyPDS2）且sgRNA将dCas9置于尽可能靠近G4的位置（约20 bp内）时，G4稳定化效果最佳。

氯烷烃修饰的配体可在细胞内有效标记dCas9-Halo

研究团队通过慢病毒转导构建了稳定表达dCas9-Halo的MCF7细胞系。利用CAPA实验，他们评估了不同修饰配体在活细胞中标记dCas9-Halo的效率。结果显示，Cl-PyPDS2在细胞内的标记效率极高（CP50 = 0.012 μM），远优于其他连接子长度的类似物，因此被选用于后续细胞实验。

通过ATENA选择性靶向MYC-G4揭示c-MYC表达无显著变化

研究人员设计了多个靶向c-MYC启动子区MYC-G4不同位置和链的sgRNA。令人意外的是，当使用Cl-PyPDS2进行ATENA靶向时，并未观察到全球c-MYC转录本的显著下调。通过深入分析，他们发现当ATENA复合物被引导至靠近P1启动子核心区域（如TATA框或转录起始位点TSS附近）时，会因空间位阻效应导致非G4依赖性的转录抑制，这提示在使用dCas9为基础的工具时，sgRNA的设计必须谨慎避开关键调控元件。

ATENA证实MYC-G4靶向与P1依赖性转录表达相关

鉴于c-MYC的表达受多个启动子（主要是P1和P2）调控，研究人员分别检测了P1和P2驱动的转录本变化。结果发现，使用能确保G4特异性靶向且不干扰核心启动子元件的sgRNA（如sgRNA_MYC-19和sgRNA_MYC-67）时，ATENA介导的MYC-G4稳定化确实导致了P1驱动的c-MYC转录特异性抑制（最高达85%），但同时伴随着P2驱动转录的补偿性上调，从而解释了为何全球c-MYC表达变化不显著。使用BG4 CUT&Tag-qPCR进一步证实，ATENA靶向后MYC-G4位点的蛋白可及性降低，支持了配体结合竞争性 displaces （置换）转录调控蛋白的模型。使用另一种G4配体PhenDC3的ATENA版本（Cl-PhenDC3₂）也得到了类似但更强的P1抑制效果，表明ATENA可用于比较不同配体在同一靶点的效力。

MYC-G4选择性分子DC-34验证ATENA

为了交叉验证ATENA的发现，研究人员使用了报道中对MYC-G4有一定选择性的小分子DC-34。与ATENA结果一致，DC-34处理也导致P1特异性c-MYC转录抑制，且不影响全球c-MYC表达，但较高浓度下仍观察到对KRAS等非靶点G4的脱靶效应，凸显了小分子实现完全选择性的难度。转录组测序（mRNA-seq）分析显示，DC-34和ATENA（经非靶向sgRNA对照过滤后）引起的差异表达基因数量远少于全局G4稳定剂PyPDS，证明了ATENA和选择性小分子均能提供更高的靶向特异性。

利用ATENA靶向c-MYC i-基序与转录刺激相关

研究人员将ATENA平台拓展至iM的靶向。他们合成了iM选择性肽Pep-RVS的氯烷烃修饰类似物（Cl-pep-RVS₄），并证实其能有效标记dCas9-Halo。当使用相同的sgRNA（sgRNA_MYC-19）引导Cl-pep-RVS₄靶向c-MYC启动子区的iM时，观察到了与G4靶向相反的效果：P1驱动的c-MYC转录被特异性激活（约2倍），同时P2转录有所下降。这揭示了同一基因座互补链上不同DNA二级结构可能具有相反的转录调控功能。

PDS可作为特定G4-蛋白相互作用的分子胶

研究人员利用ATENA探究了另一个G4位点——长链非编码RNA PVT1启动子区的G4（PVT1-G4）。此前研究发现PDS处理能上调PVT1表达。ATENA实验证实，特异性靶向PVT1-G4确实能重现PVT1的上调。令人惊讶的是，BG4 CUT&Tag-qPCR显示此时PVT1-G4位点的蛋白可及性反而增加，提示PDS可能扮演了“分子胶”（molecular glue）的角色，增强了特定蛋白与G4的结合，从而促进转录。然而，当使用PhenDC3或结构相似的PDC配体通过ATENA靶向同一PVT1-G4时，却观察到了转录抑制和蛋白可及性降低。这表明不同结构的配体结合同一G4时，可能通过改变G4的构象或蛋白结合界面，引发截然不同的功能后果。

利用ATENA靶向细胞特异性G4揭示转录依赖性配体反应

最后，研究人员利用ATENA靶向了在MCF7细胞中特异性检测到、且位于高表达基因HMGN1启动子区的G4，以及低表达基因IL17RA启动子区的G4。结果显示，靶向HMGN1-G4导致了极其强烈的转录抑制（99%），而靶向IL17RA-G4则无显著效应。这表明G4的功能重要性与其所在基因的转录活性状态密切相关，高转录活性基因的启动子G4对配体介导的稳定化更为敏感，其稳定化可能更易破坏维持高表达所需的转录机制。

本研究开发的ATENA平台成功克服了传统G4/iM配体缺乏选择性的瓶颈，为在天然染色质环境中精确解析单个DNA二级结构的生物学功能提供了强大工具。研究不仅证实了选择性靶向MYC-G4主要影响其P1启动子活性，还揭示了配体作用模式的多样性（如分子胶与蛋白置换剂）以及基因转录状态对G4功能重要性的深刻影响。这些发现强调了在理解和利用G4/iM进行靶向治疗时，必须考虑配体特性、基因组环境以及细胞特异性。ATENA平台的模块化设计使其易于扩展至其他DNA结构或配体的研究，有望在未来推动针对特定基因位点的表观遗传药物开发。同时，研究也指出了当前技术的一些局限性，如PAM序列的限制和sgRNA设计的复杂性，但随着CRISPR技术的不断发展（如PAM要求更宽松的Cas变体），ATENA的应用范围将进一步拓宽。总之，这项工作深化了我们对DNA二级结构在基因调控中复杂作用的理解，并为相关治疗策略的精准设计指明了方向。