功能性KCC2标记围产期皮层中进化保守的早熟中间神经元群

《Nature Communications》：Functional KCC2 expression marks an evolutionarily conserved population of early-maturing interneurons in the perinatal cortex

本研究针对皮层中间神经元（INs）GABA能功能成熟轨迹不清的问题，通过高分辨率皮层发育图谱、单细胞RNA测序及电生理等技术，发现KCC2可作为标记物识别一群在围产期即表达KCC2、具备超极化GABAA反应、内在兴奋性及突触整合更成熟的早熟INs。该群INs主要位于第5层、表达SST，且在人类胚胎皮层中存在同源群体，揭示了GABA能功能成熟在INs亚群间的异质性，为理解皮层早期环路发育提供了新见解。

　　

大脑皮层是一个复杂的网络，由兴奋性的谷氨酸能主神经元（PNs）和抑制性的GABA能中间神经元（INs）组成。在发育早期，GABA的作用经历了一个关键的转变：从去极化转变为超极化。这个转变主要由钾-氯共转运体KCC2的上调所驱动，它通过降低神经元内的氯离子浓度来实现。然而，这个“GABA能转换”的时间点在主神经元中已被广泛研究，通常发生在小鼠出生后第一周左右；但在中间神经元中，其发生的时间点和模式却一直是个未解之谜。理解不同神经元群体在发育过程中的异质性成熟轨迹，对于揭示早期神经环路的组装和功能至关重要。

为了解决这一关键问题，来自赫尔辛基大学等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项研究。他们发现，KCC2的表达可以作为一个可靠的标记，来识别一群在围产期（出生前后）就已经表现出超前成熟特征的中间神经元。这群“早熟”的中间神经元不仅在小鼠中存在，在人类胚胎大脑中也发现了其同源群体，表明这一发育机制在进化上是保守的。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种技术手段。他们利用了公开的小鼠高分辨率皮层发育生物信息学图谱和人类胚胎大脑单核RNA测序（snRNA-seq）数据，来追踪KCC2（基因名Slc12a5）在不同发育阶段和不同神经元类型中的表达模式。在实验方面，他们使用了表达GAD2（谷氨酸脱羧酶2，是GABA能神经元的标志）的转基因报告小鼠。通过免疫组织化学和免疫电镜技术，在胚胎期18天（E18）和出生后（P0）的小鼠体感皮层中观察KCC2蛋白的表达和亚细胞定位。关键的 electrophysiology（电生理学）实验采用了gramicidin（革兰霉素）穿孔膜片钳技术，这种技术可以无损地测量GABA的反转电位（E_GABA），从而准确判断GABA的功能是去极化还是超极化。同时，研究人员还结合了全细胞膜片钳记录来研究神经元的固有电生理特性（如放电频率、动作电位特性），并通过生物胞素填充和三维形态重建分析了神经元的树突复杂性。此外，研究还结合了单细胞patch-transcriptomics（在膜片钳记录后抽取细胞内容物进行qPCR分析）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析，将神经元的电生理表型与其基因表达谱联系起来，并进行了差异基因表达（DGE）和基因本体（GO）富集分析。人类数据分析则来源于已发表的孕17至41周的人类胚胎大脑snRNA-seq数据集。

KCC2在胚胎期E18的中间神经元中的表达早于谷氨酸能神经元

研究人员首先通过免疫组化发现，在胚胎第18天（E18），KCC2蛋白已经在皮层板（CP）、底板（SP）和中间带（IZ）的GAD2阳性INs亚群中表达，而在GAD2阴性的主神经元中则检测不到。免疫电镜进一步显示，此时的KCC2主要位于胞体和树突的胞质内运输囊泡中，提示其正在向细胞膜运输。到出生时（P0），KCC2在体感皮层第5层的INs中表达强烈，但仍主要位于胞内，膜相关信号仅占7.5%。这些结果表明，INs中KCC2的表达在发育上早于PNs。

围产期中间神经元中的功能性KCC2驱动GABA能信号极性的早期发育转变

那么，这些早期表达的KCC2是否具有功能呢？通过gramicidin穿孔膜片钳记录，研究人员发现，在出生时（P0-P2），第5层的GAD2阳性INs的GABA反转电位（E_GABA）显著比PNs更负，表明GABA在INs中已经是超极化作用。应用KCC2选择性拮抗剂VU0463271后，INs的E_GABA发生去极化，证实了其超极化的GABA反应是由KCC2依赖的氯离子外排所介导的，而PNs对拮抗剂不敏感。结合单细胞转录组数据，他们进一步确认，表达Kcc2的INs比不表达Kcc2的INs具有更负的E_GABA和更高的GABA驱动力。这表明，在围产期，一部分INs已经率先完成了GABA能功能的转换。

早期表达KCC2的围产期中间神经元表现出早熟的内在特性

接下来，研究人员探索了这群KCC2阳性INs的其他电生理特性。电流钳记录显示，与KCC2阴性INs相比，KCC2阳性INs具有更高的放电频率、更小的动作电位（AP）半宽幅、更大的后超极化（AHP）振幅以及更低的输入电阻，这些都是神经元更加成熟的电生理标志。这些发现表明，KCC2阳性INs在内在兴奋性方面也更为早熟。

早期表达KCC2的围产期中间神经元表现出显著成熟的树突形态

形态学分析进一步支持了电生理的结果。通过生物胞素填充和三维重建，研究发现KCC2阳性INs拥有更复杂的树突分枝、更多的交叉点以及更长的总树突长度。Scholl分析显示，KCC2阳性INs在各个距离上的树突交叉点数量都更多。它们的树突形态多样，包括多极形、局部树枝形和双簇形。树突总长度与最大放电频率呈正相关，进一步将形态成熟与功能成熟联系起来。

早期Kcc2表达是围产期INs中成熟表型的可靠标志物

为了明确这群早熟INs的分子身份，研究人员进行了单细胞patch-transcriptomics分析。结果显示，在记录到的第5层GAD2阳性INs中，60%表达Kcc2。其中，表达生长抑素（SST）的INs是Kcc2阳性的最主要群体（72.7%的Kcc2阳性细胞同时表达SST）。神经肽Y（Npy）和钙结合蛋白1（Calb1）也是重要的共表达标记物。重要的是，在每个IN标记物（SST， Npy， Calb1）组内，Kcc2的表达都能区分出具有更高放电频率和更超极化GABA驱动力的亚群，凸显了Kcc2作为功能成熟标志物的可靠性。

单细胞RNA测序和空间转录组分析揭示了出生时具有高水平Kcc2表达的离散中间神经元群体

对公共scRNA-seq数据集的分析确认，在出生时（P0），Kcc2在多个SST阳性INs亚型中高表达，包括未来的第5层T-Martinotti细胞、第2-5层扇形Martinotti细胞、SST阳性非Martinotti细胞以及支配第4层的SST细胞。对另一个scRNA-seq数据集（Di Bella等）的分析也表明，在E18和P1的INs中，Kcc2主要在一个富含SST表达的细胞簇（簇0）中表达。谱系追踪分析显示，大多数围产期Kcc2阳性INs表达MGE（内侧神经节隆起）来源的标记基因（如Lhx6， Nxph1），表明它们主要起源于MGE，是早期生成的INs。RNAscope原位杂交证实了Kcc2 mRNA主要在INs中表达，且在第5层密度最高，该层也是SST与Kcc2共定位比例最高的区域。

早期Kcc2/Slc12a5表达的INs显示多种促进突触发生、突触信号和成熟的基因上调

差异基因表达（DGE）分析揭示，与Kcc2阴性INs相比，Kcc2阳性INs有385个基因显著上调，而只有2个基因（Sox4和Gm17750）下调。基因本体（GO）和突触基因本体（SynGO）富集分析表明，上调的基因显著富集在与突触信号传导、突触组织、神经元连接性以及细胞投射相关的生物学过程和细胞组分中。这从基因表达水平上解释了这群细胞为何具有更成熟的特性。

早期表达KCC2的围产期中间神经元显示出明显更高的突触输入动态

与基因表达谱一致，电压钳记录发现，KCC2阳性INs的自发和微型兴奋性/抑制性突触后电流（sEPSC/sIPSC， mEPSC/mIPSC）的频率和振幅均显著高于KCC2阴性INs。这表明KCC2阳性INs接受了更多的突触输入，其突触连接性更强，在发育早期就已高度整合到局部环路中。

早期表达KCC2/SLC12A5的INs在人类胚胎大脑中被识别并显示类似的促进突触发生和成熟的基因上调

最后，研究团队将发现拓展到人类。通过分析人类胚胎大脑（孕17至38周）的snRNA-seq数据，他们发现了一个在孕中期（约20周后）开始表达KCC2的INs群体。与小鼠类似，这群人类KCC2阳性INs也高表达MGE标志物（如LHX6， NXPH1），并且一部分共表达SST。DGE分析显示，人类KCC2阳性INs同样有大量基因（492个）特异性上调，其中25个基因（如SDC3， TSPAN7， NPAS4）与小鼠中上调的基因重叠，这些基因参与突触形成、可塑性和神经递质释放。GO分析再次确认这些基因富集于突触功能和信号传导。同样，SOX4在人类KCC2阳性INs中也下调。这些发现强有力地证明了，表达KCC2的早熟INs群体在小鼠和人类之间是进化保守的。

综上所述，这项研究解决了一个发育神经生物学中的关键空白，首次明确证实了皮层中间神经元亚群在GABA能功能成熟上存在异质性。研究人员鉴定出一群在围产期就表达功能性KCC2的“早熟”中间神经元，它们主要起源于MGE，表达SST等标志物，并在电生理特性、树突形态、基因表达谱和突触连接性方面都表现出超前于其他神经元的成熟特征。更重要的是，在人类胚胎大脑中也发现了同源的细胞群体。这项工作确立了KCC2作为早期成熟中间神经元的可靠标志物。由于这群神经元在皮层环路发育早期就已高度整合，它们可能作为“枢纽”神经元，在感觉信息处理早期和神经元同步化活动的产生中扮演重要角色。该研究为理解正常皮层发育提供了新框架，其发现也可能为某些神经发育障碍（如癫痫、精神分裂症）中存在的早期连接异常提供新的病因学线索。未来，针对这群特定中间神经元的深入研究，将有助于揭示皮层网络组装的基本原理，并可能为相关疾病的诊断和治疗提供新的生物标志物和靶点。