铜绿假单胞菌群体感应诱导分子3oc12通过EGFR调控肺上皮屏障通透性以建立慢性感染的新机制

《Nature Communications》：A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing inducer controls lung permeability in establishing chronic infection via EGFR

本研究揭示了铜绿假单胞菌如何利用群体感应分子N-(3-氧代十二烷酰)高丝氨酸内酯(3oc12)通过调控表皮生长因子受体(EGFR)信号通路来精细调节肺部感染严重程度。研究人员发现3oc12可嵌入宿主细胞膜破坏脂筏结构，诱导EGFR发生配体非依赖性二聚化，进而激活STAT3信号通路，上调紧密连接蛋白表达，降低肺上皮通透性，从而限制细菌扩散，促进慢性感染建立。该发现不仅阐明了病原菌主动调控宿主以维持长期感染的新机制，也为肺通透性相关疾病治疗提供了新思路。

　　

在微生物与宿主的长期博弈中，病原体如何平衡其致病性与宿主生存能力是一个值得深入探讨的科学问题。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为一种常见的医院获得性条件致病菌，能够在免疫功能低下患者中引起严重感染，特别是对于囊性纤维化（CF）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者，该菌的长期定植是导致发病和死亡的主要原因。然而，与其它肺部细菌病原体相比，铜绿假单胞菌在肺内引起的感染虽然菌量通常很高，但临床表现相对温和，且感染可持续数年甚至数十年。传统观点认为宿主免疫反应是控制感染恶化的主要力量，但铜绿假单胞菌是否具备自身内在能力来主动促进这种向长期、解剖局限感染的转变，尚不清楚。

N-(3-氧代十二烷酰)高丝氨酸内酯（3oc12）是铜绿假单胞菌LasI/LasR群体感应系统的关键信号分子。除了在细菌间通讯中发挥作用外，3oc12对宿主细胞也具有广泛影响。此前研究发现，3oc12对质膜脂筏具有高亲和力，其插入细胞膜会导致脂筏溶解，并在免疫细胞上引起肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）的配体非依赖性聚集和激活。那么，与铜绿假单胞菌直接接触的肺上皮细胞是否会因脂筏状态的改变而影响其它膜受体信号呢？发表在《Nature Communications》上的这项研究给出了答案。

研究人员发现，铜绿假单胞菌利用其群体感应分子3oc12，通过一种意想不到的机制来精细调控肺部感染的严重程度，从而有利于其建立长期慢性感染。该机制的核心在于3oc12能够嵌入宿主肺上皮细胞膜，破坏脂筏结构，进而诱导表皮生长因子受体（EGFR）发生配体非依赖性的自发性二聚化和激活。这种激活会启动EGFR-STAT3信号通路，最终导致多种紧密连接蛋白表达上调，增强肺上皮屏障功能，降低通透性。这种屏障功能的增强反而限制了细菌从肺泡向全身循环系统的扩散，将感染局限在肺部，为慢性感染的建立创造了条件。这一发现揭示了一种病原菌自主的、主动调控宿主以维持持久感染的新策略。

为验证这一机制，研究团队综合运用了多种关键技术方法。在体内实验中，使用了铜绿假单胞菌野生型（PAO1）、3oc12合成酶缺陷株（ΔlasI）以及3oc12回补株（ΔlasR+lasI）感染小鼠模型，并结合EGFR抑制剂（厄洛替尼等）处理，通过生存分析、微生物负荷计数、组织病理学（H&E染色）、Micro-CT成像、支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞因子和蛋白分析等手段评估感染后果和肺屏障功能。在体外细胞模型（如人肺上皮细胞A549）中，通过跨上皮电阻（TEER）测量、FITC-葡聚糖通透性实验、蛋白质印迹（Western blot）、流式细胞术、定量PCR等技术检测上皮屏障完整性和紧密连接蛋白表达。在机制探索层面，采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术构建EGFR-Halo敲入细胞系进行单分子荧光追踪和扩散分析，利用单分子光漂白步进计数（SMPSC）分析EGFR二聚体形成，并通过结构化照明显微镜（SIM）观察细胞骨架。尤为重要的是，研究还进行了全原子分子动力学（MD）模拟，从原子层面揭示了不同膜相态（脂筏有序相Lo和非脂筏无序相Ld）对EGFR跨膜区二聚化的热力学和动力学影响。此外，还利用了肺上皮细胞特异性Stat3敲除小鼠（Sftpc-ert2cre-stat3^f/f）模型来验证STAT3在下游信号传导中的必要性。

EGFR在铜绿假单胞菌感染过程中被3oc12激活

研究人员首先通过动物实验发现，使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼（Erlotinib）处理的小鼠，在感染铜绿假单胞菌野生株PAO1后死亡率显著升高。使用其他两种EGFR抑制剂（PD153035和AG1478）也得到了相同结果，表明EGFR信号在感染过程中起保护作用。进一步使用不能产生3oc12的ΔlasI菌株感染时，厄洛替尼处理不再影响小鼠死亡率，而通过在ΔlasR背景中强制表达lasI（ΔlasR+lasI）回补3oc12后，厄洛替尼的效应恢复，证实3oc12介导的保护作用是通过EGFR实现的。

膜脂筏破坏导致EGFR配体非依赖性二聚化增加

体外实验表明，3oc12能以剂量依赖的方式诱导A549细胞中EGFR酪氨酸1068位点（Tyr1068）的磷酸化。使用单分子追踪技术发现，3oc12处理增加了EGFR在细胞膜上的扩散速率，使其运动模式中“自由”运动比例增加，“固定”模式减少。单分子光漂白步进计数分析进一步证实3oc12能促进细胞表面EGFR二聚体的形成。这些结果说明3oc12通过改变膜脂有序性（破坏脂筏）激活了肺上皮细胞上的EGFR。

脂筏破坏导致EGFR二聚化

全原子分子动力学模拟从分子机制上阐明了这一过程。在模拟脂筏结构的有序相（Lo）膜中，EGFR的两个跨膜区单体保持分离状态。而在模拟脂筏被破坏的无序相（Ld）膜中，两个单体通过跨膜区的一个GxxxG样基序迅速形成稳定的二聚体。能量分析表明，范德华相互作用在二聚体形成中起关键作用。热力学和动力学分析揭示，在Lo相中EGFR二聚化会导致系统熵减（不利于发生），且蛋白和脂质的扩散速率较低；而在Ld相中，二聚化在热力学上更有利，且膜流动性增强促进了二聚化过程。即使考虑近膜结构域与磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸（PI(4,5)P₂）的相互作用，或包含完整的胞外域，EGFR在Ld相膜中自发二聚化的倾向依然显著。

3oc12-EGFR轴抵御铜绿假单胞菌感染扩散

体内实验发现，抑制EGFR（厄洛替尼处理）虽然未显著改变肺内细菌负荷和部分炎症因子水平，但导致了更严重的肺组织充血、免疫细胞浸润、上皮屏障破坏、肺湿干重比降低（提示通透性增加）、BALF中蛋白和花生四烯酸水平升高。Micro-CT显示厄洛替尼处理组肺部出现更严重的化脓性病变。更重要的是，血清IL-6水平以及脾脏和肝脏中的细菌载量均显著升高，表明细菌更易穿过受损的肺上皮屏障进入循环系统和远端器官。

3oc12通过影响紧密连接蛋白表达维持上皮屏障

体外Trans-well实验表明，3oc12处理能抑制小分子量FITC-葡聚糖（4kD和10kD）穿过A549细胞单层，并显著提高跨上皮电阻（TEER）。在mRNA水平，3oc12上调了包括Claudin 1, 2, 7, 8, 10、紧密连接蛋白2（TJP2）和连接粘附分子1（JAM-1）在内的多种紧密连接蛋白的表达。体内实验也证实，能产生3oc12的ΔlasR+lasI菌株感染引起的肺损伤和屏障破坏程度轻于不能产生3oc12的ΔlasI菌株。

3oc12通过EGFR-STAT3信号通路维持肺上皮屏障

EGFR抑制剂厄洛替尼可阻断3oc12诱导的紧密连接蛋白表达上调和上皮屏障功能增强。3oc12处理能诱导STAT3酪氨酸705位点（Y705）的磷酸化，且此过程依赖于EGFR。在利用CRISPR-Cas9技术敲除stat3的A549细胞中，3oc12无法再上调紧密连接蛋白表达或改变单层细胞通透性。在肺上皮细胞（特别是肺泡II型细胞，AT2细胞）特异性敲除Stat3的小鼠模型中，PAO1感染导致更严重的化脓性病变，肺屏障损伤加剧，细菌向远端器官扩散更显著。并且，在Stat3缺陷小鼠中，ΔlasI和ΔlasR+lasI菌株感染的病理严重程度变得相似，证明3oc12的保护作用确实需要通过STAT3实现。

3oc12在急性肺损伤中发挥普遍保护作用

研究还探讨了3oc12-EGFR通路的潜在治疗价值。在盐酸（HCL）或脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤模型中，外源性给予3oc12能够显著减轻肺部炎症细胞浸润、降低BALF中蛋白和多种炎症因子（IL-1α, IL-1β, TNF-α, IL-6）水平，显示出对肺屏障的保护和治疗效应。

综上所述，该研究揭示了铜绿假单胞菌群体感应分子3oc12通过破坏宿主肺上皮细胞膜脂筏结构，诱导EGFR发生配体非依赖性二聚化，进而激活下游STAT3信号通路，上调紧密连接蛋白表达，最终降低肺上皮通透性，从而将感染局限在局部以利于建立慢性感染的新机制。这一发现不仅从“病原体自主调控”的新视角深化了对宿主-病原体相互作用的理解，揭示了病原菌为维持长期寄生而“主动”限制自身对宿主伤害的进化策略，也为干预肺上皮屏障功能障碍相关疾病（如急性肺损伤、哮喘等）提供了新的潜在靶点和思路。分子动力学模拟从原子层面阐明了膜相态调控受体二聚化的物理化学基础，为理解生物膜环境如何影响跨膜信号转导提供了重要理论依据。