基于生物信息学与实验验证鉴定特发性肺动脉高压中线粒体氧化应激潜在生物标志物COX6B1和HMGCL

《Scientific Reports》：Identification of potential biomarkers associated with mitochondrial oxidative stress in idiopathic pulmonary arterial hypertension via bioinformatic and experimental analysis

本研究针对特发性肺动脉高压(IPAH)诊断难、治疗靶点有限的问题，研究人员通过整合生物信息学分析与实验验证，开展了线粒体氧化应激(MOS)相关生物标志物的探索。研究筛选出COX6B1和HMGCL两个关键基因，构建了高效诊断模型，并在MCT诱导的大鼠PAH模型和PDGF刺激的PASMCs中验证了其通过调控mtROS和MnSOD活性参与IPAH病理过程。该研究为IPAH的早期诊断和靶向治疗提供了新思路。

　　

肺动脉高压(PAH)是一种进展性、毁灭性的肺部血管疾病，其特征是肺血管阻力进行性增加和不可逆的血管重塑，严重影响患者的心肺功能，最终导致右心衰竭甚至死亡。其中，特发性肺动脉高压(IPAH)是PAH中最常见的亚型，其发病机制复杂，早期症状不典型，诊断困难，且现有治疗方法多侧重于缓解症状，而非逆转血管病变，因此预后极差。近年来，科学研究逐渐将目光投向细胞能量工厂——线粒体。线粒体不仅是细胞产生能量的主要场所，也是活性氧(ROS)的重要来源。在生理状态下，线粒体活性氧(mtROS)参与正常的信号转导；然而，当mtROS的产生与清除失衡时，就会导致线粒体氧化应激(MOS)，引发线粒体功能障碍和细胞稳态失衡。已有证据表明，肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中的MOS与细胞异常增殖、凋亡抵抗等PAH关键病理过程密切相关。因此，深入探究IPAH中MOS的具体分子机制，寻找相关的诊断生物标志物和治疗靶点，具有重大的临床意义。

为了回答上述问题，由Yanting Zhu、Xiaoming Wang、Cui Zhai等研究人员组成团队，在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们巧妙地结合了生物信息学分析和实验验证两种手段，旨在系统性地挖掘与IPAH中MOS相关的关键基因。

研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：从GEO数据库下载IPAH患者肺组织基因表达数据集(GSE15197)进行差异表达分析；利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选与IPAH最相关的基因模块；从Molecular Signatures Database和MitoCarta3.0数据库获取线粒体与氧化应激相关基因集；采用多种机器学习算法（LASSO回归、SVM-RFE、随机森林）筛选核心枢纽基因；构建列线图诊断模型并评估其效能；使用野百合碱(MCT)诱导的大鼠PAH模型进行体内验证；在血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的PASMCs中，通过小干扰RNA(siRNA)敲低技术研究基因功能，并检测线粒体活性氧(mtROS)水平和锰超氧化物歧化酶(MnSOD)活性。

Identification of candidate mitochondrial oxidative stress-related genes in IPAH

研究首先对GSE15197数据集进行分析，在IPAH患者与正常对照的肺组织中共鉴定出3043个差异表达基因(DEGs)。通过WGCNA分析，发现蓝色基因模块与IPAH的相关性最为显著。进一步交叉分析DEGs、蓝色模块基因、线粒体相关基因和氧化应激相关基因，最终筛选出18个与IPAH中线粒体氧化应激相关的候选基因。

Function analysis of candidate mitochondrial oxidative stress-related genes

对这18个候选基因进行功能富集分析发现，它们主要富集在有机酸分解代谢、羧酸分解代谢、氨基酸代谢等生物过程，以及过氧化物酶体、线粒体相关内质网膜等细胞组分，并涉及脂肪酸降解、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等代谢通路，提示代谢紊乱在IPAH的发生发展中扮演重要角色。

Identification of hub genes related to mitochondrial oxidative stress

为了从候选基因中精确定位最具价值的核心基因，研究团队构建了三种机器学习算法模型。LASSO回归筛选出5个关键基因，SVM-RFE算法筛选出16个，随机森林算法筛选出5个。通过维恩图取交集，最终确定细胞色素C氧化酶亚基6B1(COX6B1)和3-羟甲基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶(HMGCL)为共同的核心枢纽基因。表达分析显示，这两个基因在IPAH患者肺组织中均显著上调。

Establishment of a diagnostic model of IPAH samples based on hub genes

基于COX6B1和HMGCL的表达水平，研究人员构建了一个列线图诊断模型。该模型表现出极高的诊断效能，其受试者工作特征曲线下面积(AUC)达到了0.974，决策曲线分析(DCA)也证实了该模型具有良好的临床适用性。

Validation of hub genes expressions in rat PAH model

接下来，研究在MCT诱导的大鼠PAH模型中验证了生物信息学的发现。与对照组相比，模型大鼠的右心室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI)均显著升高，肺血管出现明显的重塑和管壁增厚，血管中层细胞增殖增加、凋亡减少。实时定量PCR、蛋白质印迹和免疫组织化学结果一致表明，COX6B1和HMGCL在MCT诱导的PAH大鼠肺组织中，其mRNA和蛋白表达水平均显著上调，且主要表达于肺血管的中层。

Knockdown of hub genes inhibits mitochondrial oxidative stress in PDGF-induced PASMCs

为了探究COX6B1和HMGCL在MOS中的功能，研究在体外培养了大鼠PASMCs，并用PDGF模拟病理刺激。结果显示，PDGF处理显著增加了PASMCs内的mtROS水平，并降低了MnSOD的活性。然而，当使用特异性siRNA敲低COX6B1或HMGCL的表达后，PDGF诱导的mtROS异常积累被抑制，同时MnSOD的活性得以恢复。这表明COX6B1和HMGCL确实参与了PDGF诱导的PASMCs线粒体氧化应激过程。

综上所述，本研究通过整合生物信息学与实验验证，成功鉴定出COX6B1和HMGCL这两个与IPAH中线粒体氧化应激密切相关的潜在生物标志物。它们不仅构建了高效的诊断模型，还在动物和细胞模型中证实了其表达上调及其在调控mtROS和抗氧化酶活性中的关键作用。这项研究的意义在于，它不仅为IPAH的早期诊断提供了新的潜在工具，更重要的是揭示了COX6B1和HMGCL作为干预靶点，可能通过调节线粒体氧化应激来影响IPAH的病理进程，为开发新的治疗策略奠定了理论基础。当然，作者也指出了研究的局限性，例如生物信息学分析基于单一数据集、缺乏IPAH患者组织样本的直接验证等，这些也是未来研究需要进一步完善的方向。