一种他莫昔芬诱导的Cx3cr1-CreERT2转基因大鼠模型的构建与鉴定：用于小胶质细胞特异性基因表达研究

《Scientific Reports》：Generation and characterization of a tamoxifen-inducible, Cre driver rat for transgene expression in microglia

本研究针对大鼠模型中缺乏可诱导、细胞类型特异性基因操作工具的问题，开发并鉴定了一种新型他莫昔芬诱导的Cx3cr1-CreERT2转基因大鼠。研究人员通过BAC转基因技术，成功实现了Cre重组酶在大鼠小胶质细胞及外周CX3CR1+细胞中的特异性、可诱导表达，并与DIO-mCherry报告基因大鼠联用，证实了其高效性和特异性。该模型为在复杂行为研究中解析小胶质细胞功能提供了强大工具，填补了大鼠神经科学研究领域的重要空白。

　　

在我们的大脑中，居住着一群特殊的“免疫哨兵”——小胶质细胞（microglia）。作为中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）中常驻的免疫细胞，它们不仅负责抵御病原体入侵，更在维持大脑稳态、塑造神经环路、乃至学习记忆等高级功能中扮演着关键角色。近年来，随着研究的深入，科学家们发现小胶质细胞的功能异常与阿尔茨海默病、抑郁症、创伤性脑损伤等多种神经系统疾病密切相关。因此，开发能够精准操控小胶质细胞基因表达的工具，对于揭示其在生理和病理条件下的功能至关重要。

小鼠一直是生物医学研究的主力军，拥有丰富的遗传工具库，其中包括多种能够在小胶质细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因品系。然而，大鼠因其更大的脑容量、更接近于人类的复杂认知行为以及在某些疾病模型（如药物成瘾、高级认知任务）中的独特优势，同样是不可或缺的研究模型。遗憾的是，能够在大鼠小胶质细胞中进行可诱导、特异性基因操作的工具却十分有限。这限制了我们利用大鼠模型深入探索小胶质细胞在复杂行为背后的机制。

为了突破这一瓶颈，美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）下属国家药物滥用研究所（National Institute on Drug Abuse, NIDA）和国家老龄化研究所（National Institute on Aging）的Brandon K. Harvey博士领导的研究团队，开展了一项创新性的研究。他们的目标很明确：创造一种能够在大鼠小胶质细胞中实现他莫昔芬（Tamoxifen, TAM）诱导性基因表达的转基因工具。最终，他们成功构建并系统鉴定了一种新型的转基因大鼠模型——Cx3cr1-CreERT2大鼠。这项重要的研究成果发表在《Scientific Reports》期刊上。

研究人员运用了几个关键技术方法来达成研究目标。首先是细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome, BAC）转基因技术，他们将编码他莫昔芬诱导型Cre重组酶（CreERT2）的基因插入到包含大鼠Cx3cr1基因（编码fractalkine受体CX3CR1，是小胶质细胞/巨噬细胞的特异性标志物）的大型基因组片段中，从而确保CreERT2的表达能够模拟内源性Cx3cr1基因的模式。其次，他们利用了Cre-loxP重组系统，通过将Cx3cr1-CreERT2大鼠与另一种携带Cre依赖性mCherry报告基因（DIO-mCherry）的转基因大鼠杂交，来直观地检测和量化Cre酶的活动。此外，研究还综合运用了数字PCR（dPCR）进行基因拷贝数和表达分析，免疫组织化学（IHC）进行脑内蛋白表达的定位和共定位分析，流式细胞术（Flow Cytometry, FC）定量检测不同组织（脑、脾脏、外周血）中目标细胞群体的比例，以及复杂的行为学测试（感觉预处理任务）来评估转基因对高级认知功能的影响。所有实验动物均遵循NIH指南，并获得相关动物伦理委员会批准。

2.1 Creation of Cx3cr1-CreERT2 and microglial specific tamoxifen inducible DIO-mCherry rats

研究人员首先验证了CreERT2表达载体的功能，然后通过BAC重组工程技术，用CreERT2编码序列和牛生长激素聚腺苷酸化信号（bGHpA）替换了大鼠Cx3cr1基因BAC中的起始密码子，构建了Cx3cr1-CreERT2转基因构件。将该BAC DNA注射到Long Evans (LE) 大鼠胚胎中，获得了 founder 大鼠，命名为LE-Tg(Cx3cr1-CreERT2)3Ottc。同时，研究团队利用了一个先前已报道的Cre依赖性mCherry报告大鼠（LE-Tg(DIO-mCherry)2Ottc）。将这两种大鼠杂交，即可在他莫昔芬诱导下，在小胶质细胞中表达mCherry荧光蛋白。

2.2 Genetic and behavioral characterization of the Cx3cr1-CreERT2 rat

通过5‘和3’端连接处PCR以及数字PCR（ddPCR）分析，研究人员确认了Cx3cr1-CreERT2转基因已成功整合到大鼠基因组中。半合子（Hem）和纯合子（Hom）动物分别携带约10和20个转基因拷贝。重要的是，转基因的表达并未影响内源性Cx3cr1基因的mRNA水平。为了确保转基因的引入不会损害大鼠的认知能力，研究团队进行了一项复杂的感觉预处理行为学测试。结果显示，无论是野生型（WT）还是Cx3cr1-CreERT2半合子大鼠，都表现出了正常的奖励学习和推理能力，表明该转基因本身并未对大脑的高级认知功能产生负面影响。

2.3 Characterization of the DIO-mCherry rats using AAV-Cre

为了进一步验证DIO-mCherry报告大鼠的性能，研究人员向半合子和纯合子DIO-mCherry大鼠的纹状体注射了表达Cre重组酶的腺相关病毒（AAV-iCre）。两周后，在注射区域观察到了强烈的mCherry荧光，并且mCherry信号与Cre免疫反应性高度共定位（重叠系数OC=0.90）。纯合子大鼠的mCherry表达强度显著高于半合子，表明基因剂量效应。在未注射病毒的野生型对照中则未检测到mCherry信号。

2.4 Tamoxifen-induced Cre expression in Cx3cr1-CreERT2 rat brain colocalizes with Iba1⁺cells

这是研究的核心验证部分。将Cx3cr1-CreERT2大鼠与DIO-mCherry大鼠杂交获得的双转基因幼鼠，在出生后第10-12天连续注射他莫昔芬（TAM）或对照溶剂（VEH），并在注射后2、4、7-8周分析脑组织。通过免疫荧光染色（标记mCherry和小胶质细胞标志物Iba1）和细胞计数发现，在溶剂对照组中，约有15-20%的Iba1⁺小胶质细胞表现出他莫昔芬非依赖性的（即“泄露的”）mCherry表达。而在他莫昔芬处理组中，这一比例在注射后2周显著升高至54-67%，并且在长达8周的观察期内保持稳定（约57-60.5%），表明诱导的表达具有长期稳定性。同时，绝大多数（>90%）的mCherry⁺细胞都是Iba1⁺的小胶质细胞，证明了该工具的高度细胞特异性。研究还证实，这一系统在Sprague-Dawley (SD) 大鼠背景上同样有效，并且在体外培养的原代小胶质细胞中，4-羟基他莫昔芬（4-OHT）也能有效诱导mCherry表达。

2.5 Time and tissue dependent mCherry expression in LE Cx3cr1-CreERT2^+/-; DIO-mCherry^+/-rats.

由于CX3CR1也表达于外周免疫细胞（如单核细胞），而外周细胞的更新速度远快于脑内长期存活的小胶质细胞，研究人员利用流式细胞术分析了脑、脾脏和外周血中CX3CR1⁺且mCherry⁺的细胞比例随时间的变化。结果发现，在他莫昔芬注射后2周，所有组织中mCherry⁺的CX3CR1⁺细胞比例均显著升高。然而，到7-8周时，脾脏和外周血中的比例显著下降，而脑组织中的比例则保持稳定。这一动态变化符合外周免疫细胞快速更替、而脑内小胶质细胞长期存在的生物学特性，也提示在使用该模型研究小胶质细胞功能时，设置足够长的“洗脱期”可以有效减少外周重组细胞的干扰。

在讨论部分，作者强调了本研究成功构建的Cx3cr1-CreERT2大鼠模型的重要意义。它填补了大鼠神经科学研究中细胞特异性基因操作工具的空白，为在更接近人类复杂认知行为的大鼠模型中深入探索小胶质细胞的功能提供了强大平台。作者也客观地指出了该模型存在的一定程度的“泄露”表达（即无他莫昔芬时也有少量Cre活性），但这与其他类似的CreERT2小鼠模型报道一致，并且通过他莫昔芬诱导可以显著增强表达效率。此外，研究证实该转基因不影响大鼠的正常学习记忆能力，确保了其在行为学研究中的可靠性。

综上所述，这项研究报道了一种新型、可靠的他莫昔芬诱导型小胶质细胞特异性基因表达大鼠模型。通过多层次的严格鉴定，包括分子、细胞、组织器官乃至整体行为学水平，充分证明了该模型的有效性、特异性和实用性。这一重要工具将极大地推动利用大鼠模型进行神经免疫、神经系统疾病机制和治疗策略开发等领域的研究，特别是在 linking microglial function to complex behaviors（连接小胶质细胞功能与复杂行为）方面具有独特优势。随着更多转基因大鼠资源的出现，此类精准的基因操作工具将变得愈发重要，帮助科学家们揭开大脑奥秘的新篇章。