跑步机运动通过循环外泌体来源的let-7c-5p改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化发生和血管炎症

《Scientific Reports》：Treadmill exercise ameliorates atherogenesis and vascular inflammation in ApoE?/? mice via circulating exosome-derived let-7c-5p

本研究针对动脉粥样硬化（AS）这一慢性炎症性疾病，探讨了运动训练如何通过调控循环外泌体中的microRNA发挥保护作用。研究人员通过让ApoE-/-小鼠进行为期10周的跑步机运动，发现运动可显著减小动脉斑块面积、改善血管内皮依赖性舒张功能并增强心脏功能。机制上，运动降低了血清外泌体来源的let-7c-5p水平，进而解除其对组织金属蛋白酶抑制剂-3（Timp-3）的抑制作用，最终导致基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和炎症因子（TNF-α、IL-6）表达下降，从而减轻动脉粥样硬化病变和血管炎症。该研究揭示了运动抗动脉粥样硬化的新机制，为心血管疾病的防治提供了新的靶点和思路。

　　

在心血管疾病领域，动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）作为一种慢性炎症性疾病，始终是全球范围内导致死亡的主要原因之一。这种疾病的特征是在动脉血管壁内形成富含脂质的斑块，随着斑块的进展，血管会逐渐变硬、变窄，最终可能引发心肌梗死或脑卒中。尽管近年来在理解AS发病机制和治疗方面取得了显著进展，但其总体疾病负担依然沉重，开发新的治疗策略迫在眉睫。

生活方式干预，特别是规律的运动训练，已被证实能够有效降低AS相关的死亡率和住院率。运动能为心脏提供内源性保护，但其背后精确的分子机制，尤其是运动如何通过细胞间的“对话”来发挥保护作用，尚未被完全阐明。近年来，外泌体（exosomes）——这种纳米级的细胞外囊泡，因其能够携带蛋白质、脂质、信使RNA（mRNA）以及微小的RNA分子（microRNAs, miRNAs）等重要“货物”，并在细胞间进行传递，从而影响受体细胞的功能，而受到广泛关注。其中，外泌体来源的miRNAs在AS进展中的作用日益凸显，它们可能通过调节炎症反应、细胞凋亡等过程影响斑块的形成、发展甚至破裂。然而，这些miRNAs在运动介导的AS保护作用中扮演何种角色，仍是一个待解之谜。

发表在《Scientific Reports》上的这项研究，正是为了解开这个谜团。研究团队提出一个创新性假设：运动可能通过改变外泌体miRNAs的表达谱，来改善AS相关的血管功能障碍和斑块形成。为了验证这一假设，他们利用易发生动脉粥样硬化的ApoE基因敲除（ApoE^-/-）小鼠模型，设计了一套为期十周的跑步机运动方案，旨在深入揭示运动通过调控外泌体miRNAs影响AS的分子途径。

为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。他们使用了ApoE^-/-小鼠（购自广东医学实验动物中心）构建动脉粥样硬化模型，并实施跑步机运动干预。通过超声心动图评估心脏功能，离体血管环灌流技术分析血管内皮依赖的舒张功能和血管僵硬度。采用油红O（Oil Red O）、Masson、H&E（苏木精-伊红）、天狼星红（Sirius Red）等组织化学染色法评估动脉斑块面积、胶原含量和心肌纤维化。通过差速超速离心法从小鼠血清中分离外泌体，并利用纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和蛋白质印迹（Western blot）对其进行鉴定。采用miRNA测序和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分析外泌体及组织中miRNA和mRNA的表达水平。通过双荧光素酶报告基因实验验证let-7c-5p与Timp-3的靶向关系。最后，在体外利用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞（MOVAS）模型，通过转染miRNA模拟物（mimic）或抑制剂（inhibitor）以及小干扰RNA（siRNA）等技术，进一步在细胞水平验证let-7c-5p/Timp-3轴在调节炎症和基质金属蛋白酶表达中的作用。

3.1 跑步机运动改善动脉硬化和心脏功能

研究结果显示，与正常饮食的野生型对照组（Control）相比，高脂高胆固醇饮食的ApoE^-/-久坐组（AS-SED）小鼠的心脏重量与体重比值（HW/BW）和心脏重量与胫骨长度比值（HW/TL）均显著升高，提示心脏可能发生病理性肥厚或重构。更重要的是，超声心动图评估的心脏功能指标，包括射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）和心输出量（CO），在AS-SED组均显著降低，表明AS导致了明显的心功能不全。而经过十周跑步机运动的AS运动组（AS-EX）小鼠，这些心功能指标得到了显著改善。此外，作为反映动脉僵硬度的经典指标，脉搏波传导速度（PWV）在AS-SED组显著升高，而在AS-EX组则显著降低，说明运动有效缓解了AS相关的动脉硬化。天狼星红染色进一步证实，AS-SED组小鼠心肌存在大量纤维化，而运动干预显著减少了纤维化面积。这些结果综合表明，跑步机运动能够改善ApoE^-/-小鼠的动脉僵硬度、心脏功能并减轻心肌纤维化。

3.2 利用离体小鼠主动脉评估动脉僵硬度与内皮依赖性血管舒张反应

为了更精确地评估血管本身的生物力学特性，研究人员对离体的小鼠胸主动脉进行了机械测试。应力-应变曲线分析显示，三组小鼠（Control, AS-SED, AS-EX）的弹性纤维弹性模量（EEM）和胶原纤维弹性模量（CEM）均无显著差异。接下来，他们检测了血管对内皮依赖性舒张剂乙酰胆碱（ACh）的反应。结果发现，AS-SED组血管对Ach诱导的最大舒张程度（Rmax）虽低于Control组但无统计学差异，但其对Ach的敏感性（以pIC50值表示）则显著低于Control组。令人鼓舞的是，AS-EX组的pIC50值显著高于AS-SED组，表明运动干预显著改善了因AS而受损的血管内皮依赖性舒张功能，尽管未能完全恢复到正常水平。

3.3 跑步机运动减少动脉粥样硬化斑块形成

对主动脉的整体油红O染色（en face staining）显示，AS-SED组小鼠的主动脉斑块面积显著大于Control组，而AS-EX组的斑块面积则显著减小。对主动脉根部的横截面进行进一步分析，油红O染色证实运动减少了斑块内的脂质沉积，Masson染色则显示运动增加了斑块内的胶原含量。胶原是决定纤维帽机械强度和斑块稳定性的关键成分，胶原含量的增加通常意味着斑块更趋于稳定。此外，对巨噬细胞标志物CD68进行的免疫组织化学染色显示，AS-EX组斑块内的CD68阳性面积减小，表明运动减少了斑块内的炎症细胞浸润。这些结果共同说明，跑步机运动不仅能减轻动脉粥样硬化病变的程度，还能通过增加胶原沉积和减少炎症来增强斑块的稳定性。

3.4 外泌体分离、miRNAs分析及miRNA靶基因验证

研究人员成功从小鼠血清中分离出外泌体，经NTA、TEM和Western blot（检测标志蛋白CD9、CD63、TSG101）鉴定符合外泌体特征。随后，他们对AS-SED和AS-EX组小鼠血清外泌体进行miRNA测序，并重点关注了在心血管系统中高表达且与心血管疾病密切相关的let-7 miRNA家族。qRT-PCR验证发现，与AS-SED组相比，AS-EX组小鼠主动脉中let-7c-5p、let-7a-5p、let-7b-5p等多个let-7家族成员表达显著下调，其中let-7c-5p的下调幅度最大。因此，研究选择let-7c-5p进行深入探讨。通过生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验，研究人员证实let-7c-5p能够直接靶向结合Timp-3基因的3‘-非翻译区（3’-UTR），并负向调控其表达。

3.5 跑步机运动增加血管组织中Timp-3的表达

组织金属蛋白酶抑制剂-3（Timp-3）是基质金属蛋白酶（MMPs）的天然抑制剂，在心血管病理中扮演多重角色。免疫组织化学染色结果显示，与Control组相比，AS-SED组小鼠胸主动脉和头臂动脉中Timp-3的表达显著降低；而运动干预则使AS-EX组血管组织中的Timp-3表达显著回升。

3.6 跑步机运动降低血管中MMP-9和炎症因子的表达

动脉粥样硬化本质上是动脉壁的慢性炎症性疾病。MMP-9（基质金属蛋白酶-9）与炎症严重程度密切相关，其过度表达会降解细胞外基质，促进斑块不稳定。免疫荧光染色结果显示，AS-SED组小鼠胸主动脉和头臂动脉中MMP-9以及促炎因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达均显著高于Control组。相反，AS-EX组这些因子的表达显著降低。这表明跑步机运动能有效减轻血管炎症。

3.7 let-7c-5p通过靶向Timp-3调节MMP9表达和炎症因子

为了在细胞水平验证上述机制，研究团队在小鼠主动脉平滑肌细胞（MOVAS）中进行了功能获得性（转染let-7c-5p mimic）和功能缺失性（转染let-7c-5p inhibitor）实验，并用ox-LDL诱导细胞损伤。结果发现，过表达let-7c-5p会抑制Timp-3的表达，同时促进IL-6和TNF-α的表达；而抑制let-7c-5p则得到相反的效果。此外，直接敲低Timp-3会升高MMP-9的表达，而过表达Timp-3则抑制MMP-9的表达。更重要的是，在过表达let-7c-5p的同时过表达Timp-3（拯救实验），能够逆转let-7c-5p过表达所引起的MMP-9、IL-6和TNF-α表达升高。这些细胞实验数据证实，let-7c-5p确实是通过靶向抑制Timp-3来调节MMP-9和炎症因子的表达。

综上所述，本研究得出结论：规律的跑步机运动能够通过调节循环外泌体来源的let-7c-5p，在ApoE^-/-小鼠中发挥抗动脉粥样硬化作用。其核心机制在于：运动诱导血清和外泌体中let-7c-5p水平下降，解除了其对靶基因Timp-3的转录后抑制，导致血管局部Timp-3表达上调。增加的Timp-3进而抑制了MMP-9的活性和表达，减少了细胞外基质（尤其是胶原）的降解，有助于形成更小、更稳定的动脉斑块。同时，Timp-3的上调和相关通路的变化也抑制了促炎因子IL-6和TNF-α的表达，从而减轻血管炎症反应。

这项研究的重大意义在于，它首次揭示了运动通过循环外泌体miRNA let-7c-5p/Timp-3轴改善动脉粥样硬化的新机制，为理解运动有益心血管健康提供了全新的分子视角。不仅深化了对运动获益机制的认识，也将外泌体miRNA、血管炎症和斑块稳定性等多个关键环节联系起来，构成了一个相对完整的信号通路。let-7c-5p和Timp-3作为潜在的干预靶点，为未来开发针对动脉粥样硬化等心血管疾病的新型治疗策略（如基于miRNA的疗法）提供了重要的实验依据和思路。尽管研究存在如仅使用雄性小鼠、缺乏体内拯救实验深入验证机制等局限性，但其发现无疑推动了该领域的发展，强调了生活方式干预（如运动）在心血管疾病一级和二级预防中的重要作用及其背后的精密生物学基础。