靶向USP14通过增强线粒体自噬减轻脊髓损伤后神经细胞凋亡的研究

《Scientific Reports》：Ubiquitin-specific protease 14 inhibition promotes mitophagy and attenuates neural apoptosis after spinal cord injury

本研究针对脊髓损伤(SCI)后线粒体功能障碍导致的神经细胞凋亡难题，探讨了抑制泛素特异性蛋白酶14(USP14)的治疗潜力。研究人员通过体内外实验证实，USP14抑制剂IU1能够显著增强线粒体自噬(mitophagy)，改善线粒体功能，降低Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3等凋亡指标，促进神经功能恢复。该发现为SCI的早期干预提供了新的治疗靶点，具有重要的临床转化价值。

　　

脊髓损伤是一种毁灭性的中枢神经系统创伤，全球每年有数十万人受其影响，且预后极差。这种疾病的复杂性不仅在于原发性损伤造成的即时神经组织破坏，更在于后续的继发性损伤级联反应——包括氧化应激、线粒体功能障碍和神经细胞凋亡等过程，这些因素共同导致神经功能进行性丧失。在众多病理机制中，线粒体作为细胞的能量工厂，其功能紊乱被认为是继发性损伤的核心环节。受损的线粒体会产生过量活性氧(ROS)，触发线粒体凋亡途径，最终导致神经细胞死亡。因此，寻找能够改善线粒体功能、抑制神经细胞凋亡的有效策略，成为脊髓损伤治疗研究的重要方向。

近年来，自噬特别是线粒体自噬(mitophagy)——即细胞选择性清除受损线粒体的过程——在维持线粒体质量控制和细胞存活中的作用日益受到关注。然而，在脊髓损伤背景下，如何精确调控线粒体自噬仍不清楚。泛素特异性蛋白酶14(USP14)作为去泛素化酶(DUBs)家族成员，被发现参与自噬调控，但其在脊髓损伤中的作用尚未被探索。发表在《Scientific Reports》上的这项研究首次系统阐述了USP14抑制在脊髓损伤中的保护作用及机制。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究：通过大鼠脊髓挫伤模型进行体内实验，使用改良Allen撞击仪制作T10水平损伤；采用氧糖剥夺(OGD)处理的HT-22细胞模拟体外缺血环境；通过蛋白质印迹法(Western blot)检测USP14、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3/9等)、自噬标志物(LC3B、p62)及线粒体蛋白(ATPB、TOM20)表达；利用JC-1染色和流式细胞术评估线粒体膜电位(ΔΨm)和线粒体活性氧(mtROS)水平；通过透射电子显微镜(TEM)观察线粒体超微结构和自噬体形成；采用免疫荧光技术分析LC3B与线粒体标记物ATPB的共定位。

USP14 inhibition promote the recovery of rats after SCI

研究首先证实了USP14抑制对脊髓损伤后功能恢复的促进作用。通过BBB评分和足迹分析评估发现，IU1处理的SCI大鼠从损伤后第3天开始表现出显著改善的运动功能。组织学分析显示，IU1治疗组脊髓组织损伤程度减轻，尼氏染色表明前角神经元存活数量明显增加。这些结果说明USP14抑制对脊髓损伤具有神经保护作用。

USP14 inhibition inhibited apoptosis and enhanced autophagy after SCI

进一步机制探索发现，USP14抑制能够显著降低脊髓损伤后的细胞凋亡水平。TUNEL染色显示IU1处理组凋亡细胞数量减少，Western blot分析表明Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved caspase-9/caspase-9比值均下降。同时，自噬标志物LC3B-II/LC3B-I比值升高，p62水平降低，表明自噬流增强。免疫荧光显示LC3B与神经元标记物NeuN共定位增加，提示神经元自噬活性提高。线粒体内容物检测发现ATP合成酶β亚基(ATPB)和线粒体外膜蛋白TOM20表达恢复，表明USP14抑制有助于维持线粒体功能。

USP14 inhibition reduces apoptosis in the in vitro OGD model

体外实验进一步验证了USP14抑制的抗凋亡作用。OGD处理显著上调USP14表达，并增加凋亡相关蛋白比值。无论是药物抑制(IU1)还是基因敲低(sh-USP14)USP14，均能显著减轻OGD诱导的HT-22细胞凋亡。流式细胞术检测进一步证实USP14敲低可降低细胞凋亡比例。

USP14 inhibition alleviated OGD-induced mitochondrial dysfunction in vitro

研究深入探讨了USP14抑制对线粒体功能的保护机制。JC-1染色显示USP14敲低可逆转OGD引起的线粒体膜电位下降。mtROS检测表明USP14抑制能显著减轻OGD诱导的线粒体氧化应激。这些结果说明USP14抑制通过稳定线粒体膜电位、减少ROS积累来保护线粒体功能。

USP14 inhibition modulated mitochondrial function and apoptosis through enhancing mitophagy

最关键的研究发现是USP14抑制通过增强线粒体自噬发挥保护作用。Western blot显示USP14敲低进一步提高了LC3B-II/LC3B-I比值，降低了p62表达，同时减少了ATPB和TOM20水平，提示线粒体自噬增强。透射电镜观察发现USP14抑制组线粒体自噬体数量显著增加。免疫荧光共定位分析显示ATPB与LC3共定位斑点增多，表明线粒体自噬活性提高。此外，USP14抑制改善了OGD引起的线粒体碎片化，恢复了线粒体形态。使用自噬抑制剂3-MA处理后，USP14敲低对凋亡的保护作用被逆转，同时线粒体蛋白表达下降，证实USP14抑制的保护作用确实依赖于线粒体自噬的增强。

本研究系统阐明了USP14抑制在脊髓损伤中的保护机制：通过增强线粒体自噬，促进受损线粒体的清除，维持线粒体功能稳态，从而抑制线粒体凋亡途径，减少神经细胞死亡，最终促进神经功能恢复。这一发现不仅深化了对脊髓损伤病理机制的理解，也为临床治疗提供了新的潜在靶点。研究创新性地将USP14与线粒体自噬联系起来，揭示了去泛素化酶在调控线粒体质量控制和神经保护中的重要作用，为开发针对USP14的脊髓损伤治疗策略奠定了理论基础。