果蝇幼虫中肠肠上皮细胞特异性HHEX基因敲降的单细胞转录组图谱揭示其在肠道上皮分化中的保守调控作用

《Scientific Data》：A single-cell transcriptomic dataset of enterocyte-specific HHEX knockdown in the Drosophila larval midgut

本研究针对HHEX基因在肠道上皮分化中的作用机制尚不明确的问题，通过构建果蝇肠上皮细胞特异性HHEX敲降株系(NP1-Gal4>UAS-HHEXRNAi)，利用单细胞RNA测序技术解析了果蝇三龄幼虫中肠的细胞图谱。研究发现HHEX缺失显著降低了肠上皮细胞(EC)的丰度，但保留了其亚型多样性，揭示了HHEX在协调中肠上皮分化动态中的关键作用，为探索HHEX调控的内胚层模式在哺乳动物系统中的保守性提供了路线图。

　　

在生命科学领域，理解肠道上皮细胞的发育和分化机制一直是研究热点。肠道作为重要的内胚层器官，其上皮细胞的分化过程受到精密调控。然而，在这个过程中，一个名为HHEX（hematopoietically-expressed homeobox protein）的基因的具体作用尚不明确。HHEX是一个进化上保守的转录因子，已知在脊椎动物内胚层器官发生中发挥关键作用，参与前后轴建立以及肝胰谱系特化等重要过程。尽管有研究表明HHEX与结直肠癌发生相关，但它在肠道上皮细胞分化中的具体功能和分子机制仍不清楚。

为了解决这一科学问题，来自南方科技大学、中国科学院大学和BGI研究院的研究团队在《Scientific Data》上发表了一项创新性研究。他们利用果蝇这一模式生物，结合先进的单细胞转录组测序技术，首次构建了肠上皮细胞特异性HHEX敲降后果蝇幼虫中肠的单细胞转录组图谱，为深入研究HHEX在肠道发育中的作用提供了宝贵资源。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先利用GAL4-UAS系统构建了肠上皮细胞特异性HHEX敲降果蝇模型（NP1-Gal4>UAS-HHEX^RNAi）；然后通过酶消化法分离三龄幼虫中肠组织制备单细胞悬液；使用DNBelab C系列单细胞文库制备 kit 进行单细胞RNA测序文库构建；最后在MGI DNBSEQ-T1平台上进行测序，并通过scVI、Scanpy等生物信息学工具进行数据分析。

实验设计与果蝇品系构建

研究团队通过将NP1-Gal4品系与UAS-HHEX-shRNA-attP40品系杂交，成功获得了肠上皮细胞特异性HHEX敲降的果蝇模型。实验设置了两组：敲降组（KD组）和对照组（Ctrl组）。通过RT-qPCR验证，他们确认了HHEX在KD组中肠中的表达水平显著降低，同时观察到KD组幼虫中肠长度明显缩短，但体重没有显著变化，表明HHEX敲降特异性影响了中肠发育而不影响整体生长。

质量控制与数据集整合

经过严格的质量控制，研究人员从四个测序文库中获得了高质量的单细胞数据：对照组保留了23，100个细胞，敲降组保留了18，958个细胞。数据显示平均每个细胞检测到1，920个UMI（独特分子标识符）和1，055个基因，表明数据质量良好。通过scVI进行批次效应校正后，UMAP可视化显示不同重复之间批次效应较小，但KD组中出现了一些特有的细胞簇，提示HHEX敲降引起了特定的转录组变化。

单细胞转录组注释定义果蝇幼虫中肠功能细胞类型多样性

通过聚类分析，研究团队将细胞分为31个不同的簇，并基于已知的标记基因对这些细胞类型进行了精确注释。他们鉴定出了多种细胞类型，包括中肠前体细胞（MP）、成体肠前体细胞/肠内分泌细胞前体（AMP/EE progenitors）、成体肠前体样细胞（AMPs-like）、肠上皮细胞（ECs）、肠内分泌细胞（EEs）、HHEX敲降诱导细胞（HICs）、铜细胞和胃盲囊等。特别值得注意的是，肠上皮细胞根据代谢基因的表达特征进一步分为18个功能不同的亚型，显示了中肠细胞的功能特异性。

幼虫中肠细胞群体变化

通过比较KD组和Ctrl组的细胞比例，研究发现HHEX敲降显著影响了特定细胞群体的丰度。肠上皮细胞的总比例在KD组中明显下降，而一些HHEX敲降诱导细胞（HICs）的比例则显著增加。这些HICs细胞表达特定的Hox家族转录因子（如Antp和pb），可能代表了在HHEX缺失条件下出现的一种适应性细胞状态。此外，某些肠内分泌细胞亚型的比例也有所下降，表明HHEX在肠内分泌细胞分化中也发挥作用。

技术验证

研究通过多种方式验证了实验结果的可靠性。qPCR分析证实了HHEX敲降的效率，表型观察显示了中肠长度的变化，单细胞转录组数据也一致地显示KD组肠上皮细胞中HHEX表达水平降低。这些多层次验证增强了研究结论的可信度。

这项研究的结论部分强调了几个重要发现。首先，HHEX在果蝇中肠上皮细胞分化中扮演关键角色，其缺失会导致肠上皮细胞数量减少，但有趣的是，肠上皮细胞的亚型多样性得以保留，提示中肠稳态可能通过其他补偿机制维持消化功能。其次，研究发现的HHEX敲降诱导细胞（HICs）可能代表了肠道在发育压力下的一种适应性反应。最重要的是，这项工作首次提供了HHEX扰动下果蝇中肠的单细胞转录组图谱，为理解HHEX在肠道发育中的功能提供了精细的分子视角。

这项研究的意义不仅在于揭示了HHEX在果蝇中肠发育中的具体作用，更重要的是为探索HHEX调控的内胚层模式在哺乳动物系统中的保守性提供了路线图。由于HHEX在进化上高度保守，果蝇中的研究发现可能对理解哺乳动物（包括人类）肠道发育和相关疾病具有重要启示。例如，HHEX异常表达与多种人类疾病（如炎症性肠病和结直肠癌）相关，因此这项基础研究可能为未来相关疾病机制研究提供新的思路和候选靶点。

此外，该研究建立的单细胞转录组数据集也是一个宝贵的资源，可供其他研究人员进一步挖掘HHEX在中肠发育中的调控网络，以及探索肠道细胞分化的普遍规律。通过整合这些数据，科学家可以更深入地理解肠道稳态维持的分子机制，为未来开发相关的治疗策略奠定基础。