Prpf4通过调控DNA损伤应答和slc25a39 pre-mRNA剪接序贯调控红细胞扩增与成熟的新机制

《Cell Death Discovery》：Prpf4 sequentially regulates the expansion and maturation of erythrocyte through distinct mechanisms

本研究聚焦于红细胞生成过程中早期增殖与晚期成熟如何被精确协调这一关键科学问题。研究人员利用斑马鱼模型，揭示了剪接因子Prpf4通过截然不同的机制序贯调控这两个独立而又相互关联的进程。研究发现，prpf4功能缺失会导致早期红细胞S期和G2/M期细胞周期阻滞及凋亡增加，其机制与R-loop积累、DNA损伤及随后触发的ATM/Chk2-p53信号通路激活有关；同时，prpf4突变引起slc25a39等基因的pre-mRNA剪接缺陷，导致其mRNA下调，进而部分阻碍红细胞晚期成熟。该研究首次揭示了Prpf4在红细胞生成中的双重功能，为理解剪接因子如何协调造血过程提供了新视角。论文发表于《Cell Death Discovery》。

　　

在生命体内，红细胞负责输送氧气，其生成（即红细胞生成）是一个高度有序的多步骤过程，包括早期红系祖细胞的快速扩增和晚期的终末成熟。这两个阶段虽然紧密衔接，但调控它们的内在分子机制如何被精确协调，至今仍是一个有待深入探索的领域。Pre-mRNA剪接是基因表达调控的关键环节，在红细胞分化成熟过程中，成千上万的pre-mRNA需要被准确、高效地剪接。已有研究表明，诸如SF3B1、U2AF1、SRSF2等剪接因子的突变会扰乱正常造血，导致骨髓增生异常综合征等疾病，凸显了剪接调控在造血系统中的重要性。然而，不同的剪接因子在造血过程中扮演着独特而非冗余的角色，其具体作用和机制远未被完全阐明。

在此背景下，研究人员将目光投向了pre-mRNA加工因子4（PRPF4）。PRPF4是RNA剪接复合体的核心组分，在U4/U6 snRNA组装及U4/U6·U5 tri-snRNP形成中起关键作用。生物信息学分析显示，Prpf4在小鼠红细胞生成的早期阶段，特别是红系集落形成单位（CFU-E）细胞中高度富集，提示它可能在红细胞生成中扮演重要角色。为了验证这一假设，研究团队利用斑马鱼模型，深入探究了prpf4在确定造血过程中的功能及其分子机制。

研究发现，prpf4基因突变会导致斑马鱼胚胎出现严重的红细胞生成缺陷，表现为红细胞数量显著减少和成熟过程受损。进一步分析表明，prpf4缺失会引起早期红细胞周期阻滞在S期和G2/M期，并显著增加红细胞凋亡。从机制上讲，prpf4突变会导致DNA损伤并激活DNA损伤应答，从而触发ATM/CHK2-p53信号通路，这可能是抑制早期红细胞增殖并诱导其凋亡的重要原因。另一方面，研究还发现prpf4突变会导致外显子跳跃等pre-mRNA剪接缺陷，特别是引起slc25a39 pre-mRNA的严重剪接缺陷，导致其成熟mRNA水平显著下调，进而部分阻碍了红细胞生成晚期的成熟过程。

研究人员为开展此项研究，综合运用了多种关键技术方法。他们利用斑马鱼prpf4基因陷阱突变体模型进行表型分析，通过整体原位杂交、O-联茴香胺染色（检测血红蛋白）、流式细胞术（分析细胞周期和凋亡）以及免疫荧光染色等技术评估红细胞生成状态。机制探索方面，他们采用了蛋白质印迹法检测DNA损伤和信号通路关键蛋白，通过RNA测序和半定量/定量RT-PCR分析基因表达和剪接变化，并利用特异性抑制剂（如ATM抑制剂KU60019）和 Morpholino 敲低技术进行功能挽救实验，以验证特定通路的贡献。

prpf4功能缺失主要导致红细胞生成严重缺陷

研究首先观察到prpf4^-/-胚胎在36小时受精后（hpf）出现尾部弯曲和心脏区域血液颜色变浅等异常。至60 hpf，突变体表现出更明显的表型，包括头部和眼睛变小、心包水肿、卵黄囊扩大以及心脏区域红色显著减少。O-联茴香胺染色证实，prpf4^-/-胚胎在36 hpf和48 hpf的血红蛋白水平显著低于对照组，而注射prpf4 mRNA可挽救这些缺陷。基因表达分析显示，在26 hpf和32 hpf，prpf4突变特异地影响确定造血阶段的红细胞标志物（如hbae1.1）表达，但不影响造血干祖细胞标志物，表明prpf4在确定造血阶段的红细胞生成中发挥关键作用。

prpf4突变导致红细胞细胞周期阻滞和凋亡增加

通过Tg(gata1:DsRed)转基因斑马鱼模型，研究发现prpf4^-/-胚胎在48 hpf、54 hpf和60 hpf时，尾部造血组织（CHT）区域的红细胞数量显著减少。流式细胞术分析进一步证实了红细胞比例和数量的下降。细胞周期分析显示，突变体红细胞中处于G0/G1期的细胞比例减少，而S期和G2/M期的细胞比例增加，表明细胞周期发生阻滞。同时，Caspase-3免疫染色和TUNEL实验均显示prpf4^-/-胚胎CHT区域凋亡红细胞数量增加。

ATM/Chk2-p53通路上调参与prpf4突变体的红细胞生成缺陷

鉴于剪接因子缺失可能导致R-loop积累和基因组不稳定性，研究检测了DNA损伤标志物。蛋白质印迹和免疫荧光结果显示，prpf4^-/-胚胎中R-loop标志物S9.6和DNA双链断裂早期标志物γ-H2AX的蛋白水平显著升高，且γ-H2AX信号在红细胞中富集。同时，p53蛋白及其下游靶基因表达上调，ATM的下游效应分子p-Chk2而非ATR的下游p-Chk1蛋白水平升高，表明ATM/Chk2通路被激活。使用ATM抑制剂KU60019或p53 Morpholino均能部分挽救prpf4^-/-胚胎的红细胞生成缺陷，证实该通路参与了表型的形成。

DNA损伤诱导的ATM/Chk2-p53通路部分介导prpf4突变体的红细胞缺陷

为了进一步确认DNA损伤的作用，研究使用DNA拓扑异构酶I抑制剂Camptothecin（CPT）处理胚胎以模拟DNA损伤。CPT处理确实诱导了γH2AX水平升高和GATA1⁺细胞的DNA损伤，并导致红细胞数量减少、细胞周期阻滞以及凋亡增加，表型与prpf4突变体有相似之处，但血红蛋白减少程度较轻，提示prpf4缺失可能还通过其他途径影响红细胞成熟。

prpf4突变体中红细胞成熟受阻

形态学分析发现，prpf4^-/-胚胎中的红细胞更大、更圆，核质比显著增加。红细胞标志物gata1a的表达在突变体胚胎中持续异常高表达，而成熟红细胞中其表达本应下降。球蛋白表达谱分析显示，prpf4^-/-胚胎中βe3等胚胎型球蛋白表达异常持续，而成年型球蛋白表达下降。这些结果均表明prpf4突变体的红细胞成熟过程被阻断。

prpf4缺失导致红细胞生成相关基因的剪接异常

RNA测序分析发现，prpf4^-/-胚胎红细胞中存在大量差异表达基因和差异剪接事件，其中外显子跳跃是最主要的剪接缺陷类型。基因本体富集分析鉴定出与血红素生物合成、红细胞分化等过程相关的基因发生剪接异常，如slc25a39、abcb7、abcb10等。半定量RT-PCR验证了这些基因在prpf4突变体中的剪接模式确实发生改变。

prpf4突变体中slc25a39下调阻碍红细胞成熟

定量PCR证实，多个血红素合成相关基因在prpf4^-/-胚胎红细胞中表达下调，其中线粒体膜蛋白编码基因slc25a39的下调最为显著。整体原位杂交显示slc25a39在突变体中的表达明显减少。功能上，单独敲低slc25a39会导致斑马鱼胚胎血红蛋白合成减少、红细胞形态变圆、核质比增加以及hbbe3表达异常持续，但不影响红细胞存活，这与prpf4突变体的部分表型相似。更重要的是，向prpf4^-/-胚胎中注射slc25a39 mRNA能够部分挽救血红蛋白水平和hbbe3表达异常，表明slc25a39的表达下调是导致prpf4突变体红细胞成熟缺陷的重要原因之一。

本研究首次揭示了剪接因子Prpf4在红细胞生成中扮演的双重角色：它不仅通过维持基因组稳定性（防止R-loop积累和DNA损伤）来保障早期红细胞的正常增殖，还通过确保关键基因（如slc25a39）的正确剪接来推动晚期红细胞的成熟。这两个相对独立的机制共同确保了红细胞生成过程的顺利进行。该发现不仅深化了对剪接因子在造血系统中复杂功能的理解，也为因剪接因子突变导致的血液疾病（如骨髓增生异常综合征）的病理机制提供了新的见解。尽管Prpf4在造血干祖细胞发育中的具体作用仍有待进一步探索，但本研究无疑确立了Prpf4是协调红细胞生成早期扩增和晚期成熟过程的一个关键分子枢纽。