利用CRISPR/Cas9技术在牛成纤维细胞和MDBK细胞系中生成GATA3基因敲除模型，以评估靶向sgRNAs的效率

《Functional & Integrative Genomics》：CRISPR/Cas9-mediated generation of GATA3 knockout in Bovine Fibroblast and MDBK cell lines to assess sgRNAs targeting efficiency

本研究利用CRISPR/Cas9技术优化设计单向导RNA（sgRNA），成功敲除牛GATA3基因，生成特异性敲除的胎儿成纤维细胞（BFFs）和 MDBK 细胞系。通过体外切割实验筛选高效sgRNA（#1、#5、#8），结合MiSeq测序验证敲除效率（BFFs达42.4%-55.5%，MDBK达7.3%-28.9%），插入突变位于PAM上游2-3bp，引发提前终止密码子TAA。为牛胚胎功能研究奠定分子基础。

　　

摘要

GATA3在胚胎发育的桑椹胚阶段表达于外层细胞中，被认为是调控牛早期细胞谱系发育的关键因子。本研究开发了一种优化的体细胞验证工具，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功制备了GATA3敲除（KO）的牛胎儿成纤维细胞（BFFs）和MDBK细胞，为后续的体内研究提供了基础。这些细胞将用于深入探讨GATA3在细胞谱系分化及牛胚胎发育中的作用。具体方法包括设计针对GATA3基因不同区域的单导向RNA（sgRNAs），将其克隆到px459质粒中，将CRISPR克隆导入牛成纤维细胞和MDBK细胞系，筛选目标基因是否被成功切割并发生敲除，并通过MiSeq分析验证GATA3基因是否被有效破坏。共设计了11个导向RNA，分别靶向GATA3基因的第4和第5外显子的功能域以及第2外显子的转录起始位点。首先在体外进行切割效率测试，筛选出效果最佳的导向RNA，随后在牛胎儿成纤维细胞和MDBK细胞系中进行体内验证，并通过MiSeq分析确认敲除效果。最终确定两种有效的导向RNA：一种靶向GATA3基因的锌指结构（ZnF）功能域（分别位于第4和第5外显子的sgRNA#5和sgRNA#8），另一种靶向第2外显子的转录起始位点（sgRNA#1）。结果显示，前三种导向RNA在牛胎儿成纤维细胞中的基因敲除率为47.40%、55.5%和42.4%，在MDBK细胞中分别为11.03%、28.9%和7.3%。总体而言，这三种导向RNA成功破坏了GATA3基因，在PAM位点上游2–3个碱基对处插入了新的碱基对，导致下游区域出现提前终止密码子TAA。本研究成功制备了高效靶向GATA3基因的sgRNAs，为未来在牛胚胎中开展的功能研究奠定了分子基础，有助于进一步探讨基因功能及其对蛋白质水平的影响。

GATA3在胚胎发育的桑椹胚阶段表达于外层细胞中，被认为是调控牛早期细胞谱系发育的关键因子。本研究开发了一种优化的体细胞验证工具，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功制备了GATA3敲除（KO）的牛胎儿成纤维细胞（BFFs）和MDBK细胞，为后续的体内研究提供了基础。这些细胞将用于深入探讨GATA3在细胞谱系分化及牛胚胎发育中的作用。具体方法包括设计针对GATA3基因不同区域的单导向RNA（sgRNAs），将其克隆到px459质粒中，将CRISPR克隆导入牛成纤维细胞和MDBK细胞系，筛选目标基因是否被成功切割并发生敲除，并通过MiSeq分析验证GATA3基因是否被有效破坏。共设计了11个导向RNA，分别靶向GATA3基因的第4和第5外显子的功能域以及第2外显子的转录起始位点。首先在体外进行切割效率测试，筛选出效果最佳的导向RNA，随后在牛胎儿成纤维细胞和MDBK细胞系中进行体内验证，并通过MiSeq分析确认敲除效果。最终确定两种有效的导向RNA：一种靶向GATA3基因的锌指结构（ZnF）功能域（分别位于第4和第5外显子的sgRNA#5和sgRNA#8），另一种靶向第2外显子的转录起始位点（sgRNA#1）。结果显示，前三种导向RNA在牛胎儿成纤维细胞中的基因敲除率分别为47.40%、55.5%和42.4%，在MDBK细胞中分别为11.03%、28.9%和7.3%。总体而言，这三种导向RNA成功破坏了GATA3基因，在PAM位点上游2–3个碱基对处插入了新的碱基对，导致下游区域出现提前终止密码子TAA。本研究成功制备了高效靶向GATA3基因的sgRNAs，为未来在牛胚胎中开展的功能研究奠定了分子基础，有助于进一步探讨基因功能及其对蛋白质水平的影响。