IFFO1-IFFO2-Lamin A/C核骨架网络通过促进NHEJ修复和抑制染色体易位维护基因组完整性

《Nucleic Acids Research》：A nucleoskeleton network preserves genomic integrity by promoting NHEJ and restraining chromosome translocations

本研究聚焦于染色体易位(CT)的发生机制，揭示了由IFFO1、IFFO2和Lamin A/C构成的核骨架网络在DNA双链断裂(DSB)修复中的双重功能。研究人员通过免疫共沉淀、基因敲除模型及活细胞成像等技术，证实该网络既能通过C端与XRCC4结合促进经典非同源末端连接(c-NHEJ)修复，又能通过N端互连形成核骨架结构限制DSB末端移动，从而有效抑制CT发生。这项发现为理解核骨架在基因组稳定性维持中的核心作用提供了新范式，对相关肿瘤疾病的机制研究和治疗策略开发具有重要意义。

　　

当细胞遭遇内外源威胁时，DNA双链断裂(Double-Strand Break, DSB)的发生犹如基因组中突然出现的"交通事故"。若多个DSB同时存在，断裂末端可能发生错误连接，导致染色体易位(Chromosomal Translocation, CT)——这种基因组重排是多种白血病、淋巴瘤和实体瘤的典型驱动因素。虽然经典非同源末端连接(c-NHEJ)和同源重组(HR)是修复DSB的主要途径，但断裂末端的空间动态及其与核内结构的相互作用如何影响修复精准度，仍是领域内亟待破解的科学谜题。

以往研究表明，核骨架蛋白Lamin A/C通过稳定损伤位点和限制染色质动力学来抑制CT，而中间丝孤儿蛋白1(IFFO1)被发现能够连接核骨架与NHEJ修复机制。然而，其同源蛋白IFFO2的功能及其与IFFO1的协同作用机制尚不明确。发表在《Nucleic Acids Research》的这项研究，正是要解开这个谜团：IFFO1和IFFO2如何协作搭建连接DNA修复机器与核骨架的分子桥梁？这一网络又如何同时促进精确修复并防止错误连接？

为回答这些问题，研究团队主要运用了免疫共沉淀-质谱分析(IP-MS)技术鉴定蛋白互作网络、CRISPR/Cas9基因编辑技术构建多种基因敲除细胞系、激光微辐照活细胞成像技术动态追踪蛋白招募与DSB末端运动、酵母双杂交系统精确映射蛋白互作结构域、细胞存活率检测(克隆形成实验)评估DNA修复功能、染色体核型分析及易位报告系统定量检测CT频率。

IFFO2与XRCC4和IFFO1相互作用

研究人员通过免疫共沉淀结合质谱分析(IP-MS)发现，IFFO2与NHEJ核心因子XRCC4存在特异性相互作用，而与其他NHEJ因子如XLF或PAXX的相互作用较弱或缺失。反向IP实验证实XRCC4能富集于FLAG-IFFO2的复合物中，同时IFFO1也共纯化于该复合物，表明IFFO1和IFFO2之间存在相互连接。

IFFO1和IFFO2通过多个相互作用界面形成同源和异源寡聚体

序列和结构分析显示IFFO1和IFFO2具有高度相似性，均包含四个卷曲螺旋结构域(1A,1B,2A,2B)。通过MBP pull-down实验发现，两者均能通过1A和1B结构域形成同源二聚体，其中IFFO1主要依赖1B结构域，而IFFO2主要依赖1A结构域。异源寡聚化映射实验进一步揭示，IFFO1的1B和L2结构域与IFFO2的1A和L1结构域存在强相互作用，表明两者可通过多种可选模式形成复杂的异源寡聚体网络。

IFFO2与IFFO1冗余地桥接XRCC4和核骨架

研究发现IFFO2不仅能与XRCC4结合，还能与核骨架蛋白Lamin A/C相互作用。结构域映射显示IFFO2通过其1A结构域与Lamin A/C结合，而2B结构域负责与XRCC4结合。重要的是，XRCC4与Lamin A/C之间的相互作用在IFFO1或IFFO2单独缺失时显著减弱，在双敲除细胞中几乎消失，证明IFFO蛋白在此过程中起冗余的桥梁作用。细胞分级实验证实IFFO2与IFFO1、Lamin B1一样存在于核基质中。激光微辐照实验表明，IFFO1或IFFO2的缺失都会损害Lamin C向DSB位点的招募，双敲除效应更显著，进一步证实了它们功能的冗余性。

IFFO2与XLF和IFFO1平行参与NHEJ通路

活细胞成像显示GFP-IFFO2能被招募至DSB位点，且该过程依赖于XRCC4而非IFFO1。在DT40细胞中，IFFO2单敲除对VP16(依托泊苷)诱导的DSB不敏感，但与XLF双敲除细胞表现出更强的敏感性，表明IFFO2在XLF缺失时作为备份通路参与修复。遗传学分析显示，IFFO1-/- XLF-/-和IFFO2-/- XLF-/-细胞均比XLF-/-细胞更敏感，而IFFO1-/- IFFO2-/- XLF-/-三敲细胞敏感性最高，证明IFFO1和IFFO2在XLF缺失背景下以平行方式辅助NHEJ。报告系统检测证实双敲细胞中NHEJ修复效率降低，效果与53BP1或RIF1缺失相当。

IFFO2与IFFO1在同一通路中固定DSB末端

通过追踪mCherry-53BP1^TD在活细胞中的运动，发现IFFO2缺失显著增加VP16诱导的DSB末端的移动性。回补野生型IFFO2可恢复末端固定，但无法与XRCC4结合的C473R突变体则无此功能，表明IFFO2通过XRCC4锚定断裂末端。值得注意的是，IFFO1和IFFO2单敲与双敲在末端移动性上无显著差异，说明两者在固定DSB末端方面处于同一通路，这与它们在NHEJ修复中的平行关系不同。

IFFO2抑制染色体易位

核型分析显示，IFFO2缺失细胞在电离辐射后易位频率显著升高，回补野生型而非C473R突变体可逆转此表型。敲低XRCC4或Lamin A/C在野生型细胞中增加CT频率，但在IFFO2缺失细胞中无叠加效应，证明三者处于同一通路。重要的是，IFFO1和IFFO2单敲均升高CT频率，但双敲并未进一步加剧，表明它们以相同机制抑制CT。CRISPR/Cas9报告系统在HEK293和HT1080细胞中均验证了这一结论。

本研究系统阐明了IFFO1-IFFO2-Lamin A/C核骨架网络在基因组稳定性维持中的双重功能机制。一方面，IFFO蛋白通过C端与XRCC4结合，在XLF缺失时以平行备份方式促进NHEJ介导的末端连接修复；另一方面，它们通过N端互连形成核骨架结构，与Lamin A/C协同物理性锚定DSB末端，限制其空间移动，从而有效防止多个DSB间的错误连接导致的染色体易位。这种"促进修复"与"抑制错误"的协同机制，揭示了核骨架不仅是静态的结构支架，更是动态调控DNA修复路径选择和精准度的核心枢纽。

该研究的创新性在于发现了IFFO1和IFFO2功能上的精细分工：在NHEJ修复中表现为平行冗余关系，而在末端固定和CT抑制中则处于同一通路。这种差异反映了核骨架网络在不同生物学过程中的分子机制分化。研究还揭示了IFFO蛋白通过多种相互作用模式形成复杂网络的能力，这可能是核骨架具备动态可塑性和功能多样性的结构基础。

从疾病关联角度看，IFFO2表达水平在含有PAX3-FOXO1或MLL基因融合的肿瘤患者中显著降低，提示该网络的功能缺陷可能与特定染色体易位驱动的肿瘤发生密切相关。这为理解核纤蛋白表达异常在肿瘤进展中的作用提供了新视角，也为开发基于核骨架调控的肿瘤诊断标志物和治疗策略提供了潜在靶点。

总之，这项研究不仅深化了对核骨架在DNA损伤应答中作用的理解，更重要的是建立了一个连接核结构、DNA修复和基因组稳定性维持的统一框架，为后续探索染色体异常在疾病中的成因及干预策略奠定了重要理论基础。