iCasp9自杀基因调控基因组编辑B细胞：靶向抗原特异性与安全性的协同策略

《Molecular Therapy Oncology》：Using the iCasp9 suicide strategy to control the growth and function of genome-edited B cells with redirected antigen specificity

本研究针对B细胞免疫疗法中潜在的安全风险，开发了一种整合iCasp9自杀基因的基因组编辑策略。研究人员通过CRISPR-Cas9技术将iCasp9与靶向HER2的scFull-Ig抗体表达盒共同插入IgH基因座，实现在原发性B细胞和恶性B细胞系中高效诱导凋亡，并证实AP1903可显著抑制移植瘤生长。该策略为B细胞疗法的安全应用提供了双重保障，兼具细胞数量调控和抗体分泌调节功能。

　　

随着CRISPR-Cas9基因组编辑技术的突破，免疫细胞疗法已进入“药物细胞”时代。其中，B细胞因其天然分泌抗体的能力，成为长效递送治疗性抗体的理想载体。然而，编辑后的B细胞可能存在恶性转化风险，且过度增殖或抗体过量分泌可能导致严重副作用。目前，针对T细胞的iCasp9/AP1903自杀基因安全开关虽已成熟，但其在B细胞中的适用性尚未验证。

为解决这一问题，Jenny Léonard团队在《Molecular Therapy Oncology》发表研究，首次将iCasp9自杀基因与靶向HER2肿瘤抗原的单链全抗体（scFull-Ig）表达盒整合至B细胞IgH基因座，构建兼具靶向性和安全性的“双功能”B细胞。

研究团队运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过同源定向修复（HDR）将iCasp9-tdTomato或iCasp9-scFull-Ig表达盒插入DG75淋巴瘤细胞系、LP1骨髓瘤细胞系及健康志愿者来源的原代B细胞。利用流式细胞术分选编辑成功细胞，通过体外AP1903处理及小鼠移植瘤模型，评估iCasp9诱导的凋亡效率与耐药机制，并结合RNA测序分析转录组变化。

Optimal dosage of AP1903 and evaluation of efficacy in cell lines and primary B cells

研究发现，AP1903在100 nM浓度内对B细胞无固有毒性。编辑后的DG75和LP1细胞在AP1903处理72小时后，存活率分别下降70倍和50倍，且原代B细胞中tdTomato⁺细胞显著减少，证明iCasp9在B细胞中高效激活caspase-3/7凋亡通路。

Single-hit genome editing to integrate the iCasp9 gene while redirecting antigen specificity

单次编辑即可实现iCasp9与scFull-Ig的共表达，且P2A linker切割未影响抗体功能。编辑细胞仍能结合HER2抗原并分泌功能性抗体，证实双表达盒设计的可行性。

Effect of bi-allelic editing on suicide gene efficacy and resistance

双等位基因编辑的细胞对AP1903敏感性更高，但长期暴露后仍会筛选出耐药细胞（AP1903^r）。耐药细胞增殖速度减缓，且iCasp9与scFull-Ig表达下调。

Adaptation of malignant B cells and development of AP1903r cells

RNA-seq显示AP1903^r细胞上调了TRAILR4、BCL2、PIM1等抗凋亡基因，以及IFIT1-3等化疗耐药相关基因，提示多重生存通路参与耐药。

Expression of the IgH locus in clones developing in vitro resistance to AP1903

耐药细胞中iCasp9（CASP9）和scFull-Ig（IGKC）表达显著降低，而远端IgH恒定区（如IGHE、IGHA1/2）表达上调，表明编辑位点转录抑制。

In vivo validation of the iCasp-scFull-Ig cassette activity

在免疫缺陷小鼠模型中，AP1903治疗3天使移植瘤完全或部分缓解，延长生存期。但停药后肿瘤复发，且复发肿瘤中scFull-Ig表达降低，与体外耐药机制一致。

本研究证实iCasp9/AP1903系统可有效控制编辑B细胞的增殖与抗体分泌，并为恶性转化风险提供安全屏障。尽管耐药性问题存在，该策略可作为新辅助疗法或“微药厂”调节工具，推动B细胞免疫疗法的临床转化。其双重调控能力（细胞数量与抗体产量）为慢性病及肿瘤的长期治疗提供了新思路。