靶向KRASG12V的双特异性T细胞衔接器为结直肠癌免疫治疗提供新策略

《Molecular Therapy Oncology》：A KRASG12V-targeted bispecific T cell engager promotes immunity against colorectal solid tumor

本研究针对KRASG12V突变长期以来因缺乏结合口袋而难以靶向的治疗困境，开发了特异性靶向HLA-A*11:01/KRASG12V复合物的双特异性T细胞衔接器（TCER）。研究通过结构优化获得TCER01和TCER02两种高亲和力分子，在体外2D/3D模型中显著激活T细胞并诱导特异性肿瘤杀伤，且对正常细胞无交叉毒性。该研究为KRASG12V突变实体瘤提供了新的免疫治疗选择。

　　

在癌症治疗领域，KRAS突变一直被视为"不可成药"的靶点。这种突变像一把始终处于开启状态的开关，驱动着细胞不受控制地增殖。特别是在结直肠癌、非小细胞肺癌和胰腺导管腺癌等高度致命癌症中，KRAS基因第12号密码子的突变尤为常见，其中G12V突变约占所有KRAS突变的24%。尽管科学家们经过数十年努力，但针对KRAS^G12V突变的有效治疗方法仍然匮乏。

传统的靶向药物开发面临巨大挑战，因为KRAS蛋白表面缺乏明显的药物结合口袋。近年来，免疫治疗的发展为这一困境带来了转机。特别是基于T细胞的免疫疗法，如免疫检查点抑制剂（ICIs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，已在多种癌症治疗中展现出潜力。然而，这些方法对实体瘤的疗效仍有限，且存在制备复杂、响应率不高等问题。

在这种背景下，双特异性T细胞衔接器（TCER）技术应运而生。这类分子能够像一座桥梁，同时连接T细胞和肿瘤细胞，将T细胞的杀伤能力精准导向癌细胞。越南胡志明市医学遗传学研究所和Gene Solutions公司的研究团队基于这一思路，开发了专门靶向KRAS^G12V突变的新一代TCER分子，相关研究成果发表在《Molecular Therapy: Oncology》期刊上。

研究团队采用的主要技术方法包括：基于AlphaFold 3.0的蛋白质结构预测与优化、双特异性分子结构设计（包含TCR模拟区域、抗CD3单链可变片段和Fc区域）、生物层干涉技术（BLI）结合亲和力测定、流式细胞术功能验证、3D肿瘤球体模型评估，以及使用来自健康捐赠者的外周血单核细胞（PBMCs）进行多供体验证。

TCER分子设计与结合特性

研究人员设计了三种TCER结构（TCER01、TCER02、TCER03），均包含靶向KRAS^G12V/HLA-A11:01复合物的T细胞受体（TCR）区域和激活T细胞的抗CD3单链可变片段（scFv）。TCER01和TCER02还加入了可延长半衰期的Fc区域，而TCER03则为不含Fc的单链结构。结合实验显示，TCER01和TCER02对CD3ε的亲和力分别为2.117 nM和2.849 nM，对KRAS^G12V/HLA-A11:01复合物的亲和力分别为1.09 nM和1.24 nM，表现出优异的双特异性结合能力。

TCER介导的T细胞激活与肿瘤杀伤

在体外功能实验中，TCER01和TCER02能有效激活T细胞，表现为CD69表达上调（最高61.53%），并促进穿孔素和颗粒酶B等细胞毒性颗粒的释放。在效靶比（E:T）为5:1的条件下，TCER01和TCER02分别实现了75.03%和68.16%的肿瘤细胞杀伤率，显著高于对照组。活细胞成像结果直观展示了TCER处理组中绿色荧光标记的SW620肿瘤细胞被有效清除的过程。

分子稳定性与特异性验证

药代动力学研究显示，TCER01和TCER02在小鼠体内的半衰期分别为26.88小时和58.62小时，而缺乏Fc区域的TCER03则迅速降解。特异性评估表明，这两种TCER对KRAS^G12V9肽具有高度选择性，仅对G12D突变有微弱交叉反应（14.51%）。在测试的多种HLA等位基因中，TCER主要识别HLA-A11:01，对其他KRAS^G12V呈递HLA（如A03:01、A*02:01等）的活性较低，显示出良好的靶向特异性。

跨细胞系和供体的普适性验证

研究在K562、NCI-H520和SW620三种癌细胞系中验证了TCER的功能，发现只有在同时表达HLA-A*11:01和KRAS^G12V的细胞中才能诱导干扰素γ（IFN-γ）产生。此外，使用5名不同健康供体的T细胞进行实验，TCER01在所有供体中均保持稳定的杀伤效果，而TCER02的活性在不同供体间存在一定差异，这提示个体免疫特征可能影响治疗效果。

3D肿瘤球体模型中的疗效评估

在更接近体内环境的3D肿瘤球体模型中，TCER01和TCER02在72小时内有效清除了肿瘤细胞，且对基质细胞无显著毒性。与化疗药物奥沙利铂或伊立替康的联合使用并未进一步增强TCER的疗效，表明TCER单药治疗已能达到理想效果。

本研究成功开发了靶向KRAS^G12V/HLA-A11:01复合物的TCER分子，其中TCER01表现出最优的综合性能。该分子在体外模型中展示了高效、特异的抗肿瘤活性，良好的稳定性以及跨细胞系和供体的普适性。值得注意的是，HLA-A11:01在亚洲人群中的高分布频率（中国人群超过30%）使得这一治疗策略具有重要的临床转化价值，为约占KRAS突变患者24%的KRAS^G12V群体提供了新的治疗希望。

研究还揭示了TCER分子设计中关键要素的影响：Fc区域的引入显著延长了半衰期；TCR与抗CD3的相对空间位置影响结合亲和力；而关键残基（如V5、G6、V7）的相互作用决定了特异性识别。这些发现为后续优化提供了重要参考。

尽管本研究在临床前阶段取得了令人鼓舞的结果，但要将TCER01推向临床，仍需在人体化小鼠模型等更复杂的体内环境中进一步验证其安全性和有效性，特别是评估潜在的on-target off-tumor毒性和细胞因子释放综合征等风险。总体而言，这项工作不仅为KRAS^G12V突变肿瘤提供了有前景的治疗候选分子，也拓展了TCER技术在靶向肿瘤新抗原方面的应用范围，为发展更精准的癌症免疫治疗策略奠定了坚实基础。