缺氧应激是VCP突变ALS星形胶质细胞早期致病事件的新机制

《Stem Cell Reports》：Hypoxic stress is an early pathogenic event in human VCP-mutant ALS astrocytes

本研究针对VCP突变相关肌萎缩侧索硬化（ALS）中星形胶质细胞功能障碍的机制难题，通过人诱导多能干细胞（iPSC）技术构建疾病模型，首次揭示突变星形胶质细胞在常氧条件下即出现缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）异常活化，引发线粒体去极化、脂滴累积等代谢紊乱特征。研究通过转录组测序（RNA-seq）和CUT&RUN技术证实HIF-1α直接调控代谢重编程相关基因，并发现缺氧应激可削弱星形胶质细胞对运动神经元RNA结合蛋白（RBP）错误定位的纠正能力，为ALS靶向治疗提供了新方向。

　　

在大脑这个高度耗氧的器官中，氧气稳态的维持对细胞生存至关重要。当氧气供应不足或代谢需求激增时，细胞会启动缺氧应激反应。这一过程由缺氧诱导因子（HIF）家族主导，其中HIF-1α作为关键调控因子，在缺氧条件下稳定并入核，激活下游基因表达，调控血管生成、糖酵解、线粒体功能等生理过程。然而，当HIF-1α信号持续异常激活时，原本的保护性反应可能转向促进神经退行性变。

肌萎缩侧索硬化（ALS）作为一种致命的神经退行性疾病，其病理机制涉及多种细胞类型的功能障碍。其中，星形胶质细胞作为中枢神经系统中最丰富的胶质细胞，不仅为神经元提供营养支持，更是脑内氧气和能量代谢的关键调节者。它们通过神经-血管耦合调节血流量，并参与星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭过程。近年来研究表明，星形胶质细胞功能障碍在ALS发病中扮演重要角色，但具体机制尚不完全清楚。

值得注意的是，对多个ALS星形胶质细胞转录组数据的荟萃分析发现，缺氧反应通路是这些细胞中最显著激活的信号通路之一。这一发现令人惊讶，因为早期研究认为缺血再灌注 paradigm 可诱导星形胶质细胞的神经保护状态。这种缺氧既与神经保护相关又与神经变性相关的矛盾，凸显了深入研究缺氧应激在ALS中确切作用的必要性。

发表在《Stem Cell Reports》上的这项研究，针对VCP突变相关ALS中星形胶质细胞的功能障碍机制进行了深入探索。研究人员利用人诱导多能干细胞（iPSC）技术，从健康对照和携带ALS相关VCP突变的患者中成功分化出星形胶质细胞。通过一系列精细的实验设计，他们发现VCP突变星形胶质细胞在常氧条件下就表现出自主性的缺氧通路激活。

研究的关键发现包括：VCP突变星形胶质细胞表现出明显的HIF-1α核转位增加、线粒体膜电位去极化以及脂滴积累。通过RNA-seq分析，研究人员发现这些细胞在常氧条件下就表现出与缺氧反应相关的基因表达特征，包括糖酵解酶类、线粒体功能相关基因和促凋亡介导因子等的表达改变。CUT&RUN分析进一步证实，HIF-1α直接结合到这些基因的启动子区域，表明其转录活性异常增高。

更为重要的是，研究还探讨了这种细胞自主性的缺氧应激如何影响星形胶质细胞对运动神经元的支持功能。实验发现，正常星形胶质细胞的条件培养基能够纠正VCP突变运动神经元中SFPQ和FUS等RNA结合蛋白（RBP）的核质错误定位，而经过缺氧处理的星形胶质细胞则丧失了这种纠正能力。这一发现将星形胶质细胞的内在缺氧应激与ALS运动神经元的典型病理特征直接联系起来。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术：人诱导多能干细胞（iPSC）定向分化为星形胶质细胞和运动神经元的技术、可控低氧环境（1% O₂）处理系统、HIF-1α稳定剂二甲氧基甘氨酸（DMOG）药理干预、高内涵细胞成像分析（包括TMRM线粒体膜电位检测、Nile Red脂滴染色、CellROX活性氧检测）、RNA-seq转录组测序、CUT&RUN染色质结合位点分析，以及星形胶质细胞条件培养基（ACM）处理运动神经元的共培养模型。所有细胞系均来源于患者捐赠的皮肤成纤维细胞重编程获得的iPSC。

hiPSC衍生的VCP突变ALS星形胶质细胞显示线粒体功能障碍、脂滴积累和HIF-1α核转位增加

研究团队首先建立了从hiPSC定向分化为高纯度星形胶质细胞的成熟方案。与对照星形胶质细胞相比，VCP突变星形胶质细胞表现出显著的线粒体膜电位去极化，提示线粒体功能受损。同时，尼罗红染色显示突变细胞中脂滴数量显著增加，表明脂质代谢稳态失调。免疫荧光分析进一步发现，VCP突变星形胶质细胞在常氧条件下即出现HIF-1α核积聚显著增加，证明缺氧反应通路在蛋白水平被激活。

VCP突变星形胶质细胞表现出改变的缺氧转录反应

RNA-seq分析揭示了VCP突变星形胶质细胞在转录水平的显著改变。研究人员将差异表达基因分为五个共表达模块，其中模块M2和M3的基因在VCP突变细胞基础状态下表达即已上调，其程度类似于对照细胞经缺氧处理后的变化。这些基因富集于“对氧水平的反应”、“单糖代谢过程”等通路，包含PDK1、BNIP3、BNIP3L、HK2等典型HIF-1α靶基因。值得注意的是，这些缺氧相关基因在最近发表的ALS组织星形胶质细胞图谱中也显著富集，特别是在与氧化/线粒体应激（ALS_Ox）和炎症胶质激活（ALS_Glia）相关的亚类中。

对照星形胶质细胞的缺氧应激足以重现ALS表型

为验证缺氧应激本身是否足以诱导ALS相关表型，研究人员将对照星形胶质细胞置于1% O₂的缺氧环境中24小时。结果显示，缺氧处理导致对照星形胶质细胞出现线粒体膜电位显著去极化、脂滴数量增加以及活性氧（ROS）生成趋势增加。这些表型与VCP突变星形胶质细胞在基础状态下观察到的异常相似，且缺氧处理进一步加剧了突变细胞的表型。

对照星形胶质细胞中HIF-1α的药理稳定足以模拟ALS相关表型并揭示与线粒体和代谢稳态相关基因的结合

为直接验证HIF-1α在介导这些表型中的作用，研究人员使用DMOG对对照星形胶质细胞进行处理，化学性稳定HIF-1α。结果显示，DMOG处理足以诱导线粒体去极化和脂滴积累，模拟了VCP突变和缺氧处理的表现。CUT&RUN分析进一步发现，DMOG处理后HIF-1α与DNA的结合显著增加，识别出2425个可重复的结合峰，而基础状态下仅有228个。这些HIF-1α直接靶基因特别富集于RNA-seq中鉴定出的缺氧诱导基因，包括那些在VCP突变细胞基础状态下已经上调的基因。

缺氧应激损害星形胶质细胞介导的运动神经元RBP定位的非细胞自主性调节

最后，研究团队探讨了缺氧应激是否影响星形胶质细胞调节运动神经元中RNA结合蛋白（RBP）核质（N:C）定位的能力。实验发现，VCP突变运动神经元在基础状态下表现出SFPQ和FUS的显著N:C错误定位。正常对照星形胶质细胞的条件培养基（ACM）能够纠正这种错误定位，而经缺氧处理的对照星形胶质细胞的ACM则丧失了这种纠正能力。

本研究通过多层次的实验证据，确立了缺氧应激是VCP突变ALS星形胶质细胞中的早期致病事件。研究发现，VCP突变导致星形胶质细胞在常氧条件下即出现自主性的HIF-1α信号通路激活，引发线粒体功能障碍和脂质代谢紊乱。转录组和CUT&RUN分析证实，这种异常活化直接驱动了代谢重编程和线粒体应激相关基因的表达改变。更重要的是，缺氧应激损害了星形胶质细胞对运动神经元RNA结合蛋白错误定位的纠正能力，将胶质细胞的内在代谢紊乱与神经元的典型病理特征联系起来。

这些发现对理解ALS发病机制具有重要意义：首先，它们表明星形胶质细胞的缺氧应激是疾病早期的主动驱动因素，而非仅仅是后期继发现象；其次，研究确立了HIF-1α作为连接VCP突变与星形胶质细胞代谢异常的关键分子节点；最后，发现缺氧应激破坏星形胶质细胞-运动神经元间的支持性互动，为开发针对胶质细胞代谢异常的疗法提供了新思路。尽管本研究聚焦于VCP突变相关ALS，但考虑到缺氧信号通路在多种ALS模型中的保守性，这些发现可能具有更广泛的疾病相关性，为理解不同基因型ALS的共同致病机制提供了新视角。