调控多能干细胞培养策略提升神经类器官生成能力：蛋白质组学指导的细胞外基质与代谢平衡优化

《Stem Cell Reports》：Adjusting PSC culture for neural organoid generation

本研究针对非指导性大脑类器官生成中多能干细胞(PSC)质量差异导致的神经分化能力不稳定问题，通过蛋白质组与磷酸化蛋白质组分析，揭示了细胞外基质(ECM)相互作用异常和氧化代谢亢进是分化能力差的关键特征。研究人员通过优化培养基质（层粘连蛋白521）、维持FGF2稳态供给及调节氧化应激，显著提升了部分低分化潜能细胞系的类器官结构完整性。该研究为标准化类器官培养体系提供了分子机制支撑，对神经发育研究与疾病建模具有重要意义。

　　

在干细胞研究领域，人类多能干细胞（PSC）分化的神经类器官为模拟大脑发育和疾病提供了革命性工具。尤其是非指导性（unguided）大脑类器官，能够自发形成具有复杂细胞类型和空间结构的神经组织，媲美早期人脑发育。然而，这类类器官的生成高度依赖起始PSC的质量，不同细胞系间分化能力差异显著，导致实验结果可重复性低，成为领域内亟待解决的瓶颈问题。

为揭示神经类器官分化能力差异的内在机制，英国医学研究理事会分子生物学实验室的Madeline A. Lancaster团队在《Stem Cell Reports》上发表研究，通过系统性比较“分化能力强”与“分化能力差”的PSC细胞系，从蛋白质组和磷酸化蛋白质组层面挖掘关键调控因子，并针对性优化培养条件，显著提升了低潜能细胞系的类器官生成效率。

关键技术方法概述

研究选取6个人PSC系（3个高潜能系如H9、H1、KOLF2，3个低潜能系如FIAJ1、BURB1），采用非指导性类器官分化方案。通过TMT标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析蛋白质组（5,798个蛋白）和磷酸化蛋白质组（13,697个磷酸肽），结合差异表达分析、基因本体（GO）富集和方差敏感模糊聚类（VSClust）鉴定关键通路。功能验证包括免疫荧光染色（SOX2、TBR2等神经标记物）、线粒体形态分析、葡萄糖/乳酸代谢检测，并测试了层粘连蛋白521（L521）基质、FGF2缓释系统（DISCs）、抗氧化剂（NAC、谷胱甘肽）等干预策略。

研究结果

1. 蛋白质组学揭示分化能力相关的分子特征

通过对比高低潜能细胞系，发现低潜能细胞中129个蛋白上调、78个下调（Fold Change>1.5）。GO分析显示，上调蛋白富集于细胞外基质组织、三羧酸循环（TCA cycle）和氧化磷酸化（OxPhos），而下调蛋白涉及NAD代谢。磷酸化蛋白质组进一步提示细胞黏附和细胞骨架重组异常。聚类分析明确低潜能细胞特征为氧化代谢亢进和细胞骨架重构。

2. 细胞骨架与黏着斑异常受基质调控

低潜能细胞在玻连蛋白（VTN）上呈现更短宽的肌动蛋白纤维和增大的黏着斑。更换为L521基质后，细胞骨架形态差异消失，表明基质类型直接影响细胞力学特征。然而，直接抑制黏着斑下游效应因子SRC未能显著改善分化，提示ECM调控的复杂性。

3. 氧化代谢亢进限制分化潜能

低潜能细胞线粒体形态更圆、轮廓更规则（提示功能应激），且复合体I和V蛋白表达升高。代谢检测显示其糖酵解效率略低，但降低培养基葡萄糖浓度或补充NAD+均未改善分化结果。联合抗氧化剂（NAC/谷胱甘肽）与SRC抑制剂可部分提升BURB1细胞的神经上皮结构。

4. 综合优化策略提升类器官质量

L521基质联合FGF2缓释系统可显著改善BURB1和SOJD3类器官的SOX2+神经上皮比例；几何约束培养（微图案化）也能局部增强结构有序性。但针对FIAJ1细胞的优化效果有限，表明细胞内在变异性的存在。

结论与意义

本研究首次通过多组学整合分析，将PSC的神经类器官分化能力关联到ECM互作和代谢平衡两大核心机制。研究证实，优化培养条件（如L521基质、FGF2稳态供给）可部分“挽救”低潜能细胞系，但需针对细胞系特性定制策略。该工作不仅为类器官标准化提供了实操指南，更深化了对PSC状态决定分化命运的认知，为发育模型优化和精准疾病建模奠定基础。