Prefoldin 3通过调控WRKY70和FHY3的蛋白周转以调节拟南芥UV-B诱导的下胚轴生长抑制

《Plant Communications》：Prefoldins 3 promotes the turnover of WRKY70 and FHY3 to modulate UV-B-induced hypocotyl growth inhibition in Arabidopsis thaliana

本研究揭示了拟南芥中Prefoldin 3 (PFD3)作为紫外线-B (UV-B)信号通路的新型负调控因子。研究人员发现，在UV-B照射下，PFD3通过促进转录因子WRKY70和FHY3的蛋白酶体降解，进而分别抑制HY5/PRE1和COP1的转录活性，从而负调控UV-B诱导的下胚轴生长抑制。该研究不仅阐明了PFD3-WRKY70-HY5/PRE1和PFD3-FHY3-COP1这两个新的调控模块，还发现高原生态型Tibet-0中FHY3的等位变异使其能够逃避PFD3的抑制，这为理解植物对高UV-B环境的适应性进化提供了重要见解。

　　

阳光是植物生长不可或缺的能量来源，但其中包含的紫外线-B (UV-B, 280-315 nm) 却是一把双刃剑。适量的UV-B能调控植物的光形态建成（如抑制下胚轴伸长）、气孔关闭、开花时间以及次生代谢物的积累等重要生理过程，而不引起损伤。然而，过量的UV-B则会对植物造成胁迫，甚至损伤DNA。为了应对这种复杂的光环境，植物进化出了精细的感知和信号转导系统。其中，UV-B光受体UVR8 (UV RESISTANCE LOCUS 8) 及其下游的关键调控因子，如E3泛素连接酶COP1 (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1) 和转录因子HY5 (ELONGATED HYPOCOTYL 5)，构成了UV-B信号通路的核心框架，即经典的“RUP1/2-UVR8-COP1-HY5/HYH”通路。尽管该通路的主干已经清晰，但植物如何精确调控UV-B信号强度以平衡生长发育和胁迫应答，其具体分子机制仍有许多未知之处，尤其是在蛋白质稳定性调控层面。

为了深入探索UV-B信号调控的新机制，研究人员将目光投向了Prefoldin (PFD) 蛋白家族。PFD是一个呈水母状的异源六聚体分子伴侣复合物，由两个α亚基（PFD3和PFD5）和四个β亚基（PFD1, PFD2, PFD4, PFD6）组成。传统上认为PFD在细胞质中作为分子伴侣，协助肌动蛋白和微管蛋白等细胞骨架蛋白的正确折叠。然而，近年研究发现PFD亚基也能进入细胞核，参与转录调控和蛋白稳定性调控。例如，拟南芥中的PFD4被报道能与HY5互作，并促进其泛素化降解，从而负调控植物的低温适应性。这些发现提示PFDs可能在光信号转导中扮演重要角色。那么，PFD家族的其他成员，特别是PFD3，是否也参与调控UV-B信号？其作用机制又是怎样的？为了回答这些问题，由Yan Song、Jian-Quan Liu和Huan-Huan Liu等人组成的研究团队在《Plant Communications》上发表了他们的最新研究成果。

本研究综合利用了分子生物学、生物化学和遗传学等多种关键技术方法。研究主体采用拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型(Col-0)及其相关突变体和转基因株系。关键实验技术包括：酵母双杂交(Y2H)筛选和验证、双分子荧光互补(BiFC)、体外Pull-down、免疫共沉淀(Co-IP)、分裂荧光素酶(split-LUC)和双荧光素酶报告基因(dual-LUC) assays以验证蛋白质相互作用；染色质免疫共沉淀(ChIP)-qPCR和凝胶阻滞(EMSA) assays以分析转录因子与DNA的结合；体外和半体内蛋白质降解实验以评估蛋白稳定性；RNA测序(RNA-seq)和实时定量PCR (RT-qPCR)以分析基因表达；以及通过遗传杂交构建双突变体并进行表型分析，以确定基因间的上下游关系。

PFD3负调控UV-B诱导的下胚轴生长抑制

研究人员首先发现，UV-B照射能显著上调PFD3在转录水平和蛋白水平的表达。与野生型(Col-0)相比，pfd3功能缺失突变体的下胚轴在UV-B照射下表现出更强的生长抑制，而PFD3过表达株系(PFD3-OE)的下胚轴则更长。这表明PFD3负调控UV-B诱导的下胚轴生长抑制。转录组分析进一步揭示，pfd3突变体中许多UV-B光形态建成的正调控因子（如MYB12）表达上调，而下胚轴伸长相关基因（如IAA3, SAUR15, PRE1）表达下调，这与表型观察结果一致。

PFD3与WRKY70和FHY3发生物理相互作用

为了寻找PFD3的作用伙伴，研究人员通过酵母双杂交筛选，发现了两个关键的转录因子：WRKY70和FHY3。WRKY70是WRKY转录因子家族成员，已知参与植物发育和胁迫应答；FHY3 (FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL 3) 是光敏色素信号的正调控因子，能直接激活COP1的表达。后续的BiFC、Pull-down、Co-IP和split-LUC实验均在体外和体内证实了PFD3与WRKY70和FHY3之间存在直接的物理相互作用，且这种相互作用在UV-B照射下依然存在。

WRKY70正调控UV-B诱导的下胚轴生长抑制

研究人员接着探究了WRKY70在UV-B响应中的作用。表型分析显示，wrky70突变体对UV-B诱导的下胚轴抑制不敏感，而WRKY70过表达株系(WRKY70-OE)则表现出更强的抑制。这表明WRKY70是UV-B诱导下胚轴生长抑制的正调控因子。基因表达分析发现，在WRKY70-OE植株中，HY5和MYB12等正调控因子表达升高，而PRE1和PRE5等负调控因子表达降低。

WRKY70直接调控HY5和PRE1的表达

通过对HY5和PRE1启动子序列的分析，研究人员发现了多个WRKY70可能结合的W-box或WT-box顺式元件。ChIP-qPCR实验证明，在UV-B照射下，WRKY70能特异性地富集HY5和PRE1启动子的特定区域。EMSA实验进一步证实了WRKY70能直接结合这些位点。双荧光素酶报告基因实验表明，WRKY70在UV-B条件下能激活HY5的转录，同时抑制PRE1的转录。

PFD3通过促进蛋白酶体降解抑制WRKY70/FHY3的转录调控活性

机制探索发现，PFD3本身不直接结合HY5或PRE1的启动子，但能削弱WRKY70与其靶DNA的结合能力。同样，PFD3也能抑制FHY3与其在COP1启动子上的结合位点(FBS)的结合。双荧光素酶报告基因实验证实，PFD3能抑制WRKY70对HY5的激活和对PRE1的抑制，也能抑制FHY3对COP1的激活。更重要的是，蛋白质降解实验表明，WRKY70和FHY3本身是不稳定的蛋白，其降解依赖于蛋白酶体途径。而在PFD3过表达背景下，WRKY70和FHY3的稳定性显著降低。在体实验也证明，在pfd3突变体背景下，WRKY70和FHY3的蛋白积累量更高，尤其是在UV-B照射后。这些结果表明，PFD3通过促进WRKY70和FHY3的蛋白酶体降解，从而负调控其转录活性。

PFD3以UVR8依赖的方式作用于WRKY70和FHY3的上游

遗传学分析显示，pfd3 wrky70和pfd3 fhy3双突变体的下胚轴表型分别与wrky70和fhy3单突变体相似，表明PFD3作用于WRKY70和FHY3的上游。此外，pfd3 uvr8双突变体的表型与uvr8单突变体无显著差异，说明PFD3对下胚轴生长的调控依赖于UVR8光受体。

FHY3的等位变异可能驱动拟南芥对高原强UV-B辐射的局部适应

研究人员比较了低海拔生态型Col-0和高海拔生态型Tibet-0对UV-B的响应。发现Tibet-0的下胚轴在UV-B照射下表现出更强的生长抑制，且UV-B信号通路相关基因（如COP1）的表达响应更强烈。序列分析发现，Tibet-0的FHY3蛋白存在六个氨基酸变异，而PFD3和WRKY70的变异在其他生态型中也存在。蛋白质结构预测显示，FHY3^Tib与FHY3^Col之间存在显著的结构差异(RMSD = 18.207 ?)。互作实验表明，PFD3无法与Tibet-0来源的FHY3全长蛋白或其片段替换变体相互作用。功能互补实验证实，在fhy3突变体中回补FHY3^Tib比回补FHY3^Col导致更短的下胚轴和更高的COP1表达。这表明Tibet-0中FHY3的等位变异使其能够逃避PFD3的负调控，从而维持更强的COP1介导的UV-B信号，这可能是其对高UV-B环境的一种适应性进化。

本研究鉴定出分子伴侣蛋白PFD3是拟南芥UV-B信号通路中的一个关键负调控因子。它通过直接相互作用并促进两个正调控转录因子WRKY70和FHY3的蛋白酶体降解，从而减弱下游HY5/PRE1和COP1的转录活性，最终抑制UV-B诱导的下胚轴生长抑制。研究揭示了PFD3-WRKY70-HY5/PRE1和PFD3-FHY3-COP1这两个新的调控模块，它们以UVR8依赖的方式精细调控UV-B信号。此外，在高海拔生态型Tibet-0中发现的FHY3等位变异，使其能够规避PFD3的抑制，这为理解植物如何通过遗传变异适应高强度UV-B环境提供了新的视角。该研究不仅深化了对植物UV-B信号转导复杂调控网络的认识，也为未来作物抗逆育种提供了潜在的理论依据和基因资源。