蒺藜苜蓿共生体膜定位的阳离子氨基酸转运蛋白MtCAT1b/MtCAT1c调控共生固氮的新机制

《Plant Communications》：Symbiosome membrane-localized cationic amino acid transporters support symbiotic nitrogen fixation in Medicago truncatula

本研究针对豆科植物与根瘤菌共生固氮过程中共生体膜(SM)上氨基酸交换的分子机制尚不明确的问题，研究人员聚焦蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中阳离子氨基酸转运蛋白(CAT)家族，通过蛋白质组学、基因编辑和细胞生物学等技术，鉴定出两个定位于SM的关键氨基酸转运蛋白MtCAT1b和MtCAT1c。研究发现，这两个转运蛋白介导宿主与根瘤菌间的氨基酸交换，其功能缺失会导致类菌体代谢异常、ATP合成减少及固氮效率显著下降。该成果揭示了植物侧氨基酸转运在共生固氮中的关键作用，为优化共生固氮效率提供了重要分子靶点。

　　

豆科植物，如我们熟悉的大豆、苜蓿等，拥有一项令人惊叹的“超能力”——它们能够与土壤中的根瘤菌建立互利共生的关系，形成特殊的根瘤器官。在根瘤中，植物为根瘤菌提供住所和碳源，而根瘤菌则将空气中游离的氮气转化为植物可以直接利用的氨，这个过程被称为共生固氮(Symbiotic Nitrogen Fixation, SNF)。这不仅是自然界最重要的氮肥来源，也对可持续农业的发展至关重要。

根瘤内部的核心是成千上万的“共生体”(symbiosome)，每个共生体就像一个微型的共生工厂，由一个分化的根瘤菌（称为类菌体，bacteroid）、共生体空间(SS)和包裹在外层的共生体膜(SM)组成。共生体膜是植物来源的膜结构，它如同一个精密的海关口岸，严格控制着植物和类菌体之间营养物质和信号的交换。长期以来，科学界公认的经典模型是：植物通过共生体膜上的转运蛋白向类菌体提供二羧酸盐（如琥珀酸）作为碳源，而类菌体则将固定的铵(NH₄⁺)回馈给植物。

然而，越来越多的证据表明，除了二羧酸盐和铵的交换，氨基酸的跨膜循环也扮演着关键角色。从根瘤菌的角度，一些研究发现，类菌体自身合成某些氨基酸（如支链氨基酸）的能力下降，需要依赖宿主植物供给；同时，类菌体也可能将一些氨基酸（如丙氨酸、天冬氨酸）分泌给植物。这种“氨基酸交换”被认为能更精细地协调双方的代谢，从而支持高效的固氮作用。尽管在根瘤菌中已经发现了一些参与氨基酸运输的转运蛋白基因，其突变会导致固氮缺陷，但一个根本性问题悬而未决：在植物一侧，共生体膜上是否存在负责氨基酸转运的“守门人”？这些蛋白的身份是什么？它们如何工作？这些问题一直是该领域知识体系中的一个重要空白。

为了填补这一空白，由中国科学院微生物研究所孔昭胜研究员和张霞霞副研究员团队领导的研究小组，在《Plant Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们成功地鉴定出蒺藜苜蓿共生体膜上两个关键的阳离子氨基酸转运蛋白，并系统揭示了它们在共生固氮中不可或缺的功能。

为开展本研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法：通过共生体膜蛋白质组学技术筛选候选转运蛋白；利用激光共聚焦显微镜和免疫电镜技术进行蛋白亚细胞定位；通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建单基因和多重基因敲除突变体进行表型分析；采用酵母异源互补实验验证转运蛋白的底物特异性；并借助转录组测序和生化分析探究突变体类菌体的代谢变化。研究所用植物材料为蒺藜苜蓿生态型R108和A17，其共生根瘤菌为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) 2011菌株。

研究结果

1. 共生体膜蛋白质组学鉴定出高表达的CAT家族氨基酸转运蛋白

研究人员首先从蒺藜苜蓿根瘤中成功分离出共生体膜，并通过液相色谱-质谱联用(LC/MS-MS)技术进行了蛋白质组学分析。在鉴定出的膜蛋白中，他们重点关注具有转运活性的蛋白。分析结果揭示了三个属于阳离子氨基酸转运蛋白(Cationic Amino Acid Transporter, CAT)家族的成员，根据系统发育分析将其命名为MtCAT1a、MtCAT1b和MtCAT1c。进一步的转录组数据分析显示，MtCAT1b和MtCAT1c在根瘤中，特别是在固氮区(ZIII)和受感染的细胞中高度特异性表达，而MtCAT1a的表达量极低。这提示MtCAT1b和MtCAT1c很可能在根瘤共生过程中扮演重要角色。

2. MtCAT1b和MtCAT1c定位于共生体膜

为了确认这些蛋白的位置，研究人员构建了由自身启动子驱动的GFP融合蛋白表达载体，并稳定转化到蒺藜苜蓿中。激光共聚焦显微镜观察发现，GFP-MtCAT1b和GFP-MtCAT1c的绿色荧光信号清晰地定位在根瘤细胞内包裹着类菌体（用红色荧光标记）的膜结构上，即共生体膜。通过免疫荧光和免疫胶体金电镜技术对互补表达标签蛋白的植株进行观察，进一步证实了MtCAT1b和MtCAT1c特异性地定位于共生体膜。这表明它们处于理想的位置来介导植物细胞质和类菌体之间的氨基酸交换。

3. MtCAT1基因功能缺失损害共生固氮

为了探究其功能，研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了MtCAT1a、MtCAT1c的单基因敲除突变体以及MtCAT1a/MtCAT1b/MtCAT1c的三重突变体。表型分析发现，与野生型相比，MtCAT1c单突变体和三重突变体在接种根瘤菌后生长显著变差，植株鲜重和地上部总氮含量明显降低。尽管突变体的根瘤数量没有变化，但根瘤变小，其固氮酶活性（通过乙炔还原法测定）在接种后3周和5周均显著下降。值得注意的是，MtCAT1a单突变体没有表现出明显表型，这与其低表达水平一致。重要的是，在未接种根瘤菌或施用高浓度硝酸盐（抑制结瘤）的条件下，突变体与野生型植株生长无差异，证明其表型缺陷确实源于共生固氮功能的受损。

4. MtCAT1c突变导致类菌体代谢异常

对突变体根瘤的深入分析发现，其根瘤分区结构正常，但透射电镜观察揭示了一个关键现象：在cat1c突变体的成熟类菌体中，异常积累了大量的聚-β-羟基丁酸酯(PHB)颗粒。PHB是根瘤菌的一种碳储存物质，在自由生活的根瘤菌或侵染线中的根瘤菌中常见，但在正常工作的成熟类菌体中通常很少存在。PHB的积累暗示类菌体的碳氮代谢平衡被打破。对突变体类菌体的转录组分析显示，与氨基酸转运代谢、碳水化合物转运代谢相关的基因表达发生显著改变。基因集富集分析进一步证实碳氮代谢通路受到扰动。相应地，突变体类菌体内的ATP含量也显著降低，这可能是导致固氮酶活性下降的直接原因之一。

5. MtCAT1b和MtCAT1c具有广泛的底物特异性并可形成寡聚体

通过酵母异源表达系统，研究人员验证了这些转运蛋白的功能。他们将MtCAT1基因在一种自身缺乏多种氨基酸转运能力的酵母突变株中表达，发现MtCAT1b和MtCAT1c能够转运多种氨基酸，包括精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)等，表明它们具有较宽的底物谱。此外，通过双分子荧光互补和酵母双杂交实验，证明MtCAT1b和MtCAT1c能够自身或相互之间发生相互作用，形成同源或异源寡聚体，这可能对其在膜上的正确定位和功能发挥是必要的。

结论与意义

本研究首次在分子水平上鉴定并功能验证了豆科植物蒺藜苜蓿共生体膜上两个关键的氨基酸转运蛋白MtCAT1b和MtCAT1c。研究结果表明，它们通过介导植物与根瘤菌之间的氨基酸交换，对维持类菌体的正常代谢状态和高效的共生固氮至关重要。当MtCAT1b或MtCAT1c的功能丧失时，共生界面的氨基酸交换受阻，导致类菌体代谢紊乱（表现为PHB积累、ATP合成不足），最终使得固氮效率大幅下降。

该研究的发现具有多重重要意义：首先，它填补了长期以来关于植物侧如何参与共生过程中氨基酸交换的知识空白，为经典的“二羧酸盐-铵”交换模型提供了重要的补充和支撑。其次，研究揭示了CAT家族转运蛋白在有益植物-微生物互作中的新功能，拓展了人们对氨基酸转运蛋白生物学功能的认知。第三，同源蛋白GmAPC1在大豆共生体膜蛋白质组中的存在提示，这种由CAT转运蛋白介导的氨基酸交换机制可能在豆科植物中具有保守性。最后，该研究鉴定出的关键转运蛋白基因MtCAT1b和MtCAT1c，为未来通过遗传改良手段优化豆科作物的共生固氮效率、减少对化学氮肥的依赖提供了有价值的分子靶标，对推动可持续农业发展具有潜在的应用价值。