综述：环状RNA生物发生的特征及生物医学意义

《TRENDS IN Genetics》：Features and biomedical relevance of circular RNA biogenesis

本综述系统阐述了环状RNA（circRNA）的四类亚型（ecircRNA、ElciRNA、ciRNA、mecciRNA）的生物发生机制，重点解析了顺式作用元件（cis-elements）和反式作用因子（trans-factors）如何精确调控其组织特异性表达。文章进一步探讨了circRNA生成失调与人类疾病（如癌症、神经退行性疾病、男性不育等）的关联，并展望了体外合成circRNA作为新型疫苗和药物的广阔应用前景，为相关领域研究提供了重要见解。

　　

环状RNA的生物发生：机制、调控与生物医学意义

环状RNA（circRNA）是真核生物转录和RNA加工过程中天然产生的共价闭合单链RNA分子。它们在细胞类型、组织和发育阶段中表现出高度特异性的表达模式，其中相当一部分在进化上保守。在动物细胞中，目前已鉴定出四类circRNA亚型：外显子circRNA（ecircRNA）、外显子-内含子circRNA（ElciRNA）、内含子circRNA（ciRNA）和线粒体编码的circRNA（mecciRNA）。这些circRNA具有多样的作用模式，例如在细胞核内调控转录和选择性剪接，在细胞质中与microRNA和蛋白质相互作用，以及在部分情况下编码功能性多肽。circRNA已成为多种生理过程（如发育和衰老）中的关键调控因子，并且越来越多的证据表明其与神经退行性疾病、心血管疾病、不育症和癌症等人类疾病密切相关。

环状RNA各亚型的生物发生机制

不同circRNA亚型的生物发生具有独特的特征，并受到精密调控以维持稳态及生理和病理活动。

反向剪接调控的分子基础

ecircRNA和ElciRNA是通过其同源前体mRNA的反向剪接产生的。该过程由多种顺式作用元件和反式作用因子共同 orchestrate。反向剪接需要剪接体组分的参与，并被认为与经典（线性）剪接以协调的方式相互竞争。这种竞争可以调节mRNA与circRNA的比例，从而影响基因表达。值得注意的是，转录和反向剪接也是协调进行的，RNA聚合酶II（Pol II）转录延伸速度的增加与circRNA形成的增多相关。在人类和模式生物中，与年龄相关的circRNA水平升高可能是由快速的Pol II延伸引起的。

顺式作用元件，包括短或长的侧翼内含子重复序列、外显子-内含子边界（EIB）以及3‘非翻译区（UTR），通过拉近环化外显子的空间距离来促进反向剪接。在circRNA侧翼内含子中最常富集的顺式元件是人类中的Alu元件和小鼠中的B1重复序列。然而，一些高丰度且广泛表达的circRNA，如CDR1as/ciRS-7和circRMST，是由保守的哺乳动物广泛散布重复序列（MIR）驱动的。此外，参与反向剪接的EIB中的剪接位点突变可显著降低其环化效率，并干扰线性剪接。但在某些情况下，3’ UTR区域可能在不干扰线性剪接的前提下参与反向剪接调控，例如，在FBXW4和CRKL基因中，CRISPR/Cas9介导的其3‘UTR内ZC3H14结合位点的基因组缺失，会分别导致circFBXW4和circCRKL水平降低，而不影响其同源mRNA的水平。

反式作用因子，如RNA结合蛋白（RBP），通常与pre-mRNA上的顺式元件协同作用来调控反向剪接。Quaking（QKI）、FUS、MBNL1、ILF3（也称为NF90/110）、SAM68、SFPQ、NOVA2和ELAV是已知的通过调控circRNA侧翼内含子序列来促进circRNA形成的RBP。近期研究发现，ZC3H14通过结合circRNA的EIB及其同源pre-mRNA的3’UTR，成为一个保守的circRNA生物发生促进因子。像ZC3H14和QKI这样的RBP可以二聚化并与剪接体结合以促进反向剪接，而DHX9、ADAR1、hnRNPM和hnRNPD则通过破坏侧翼内含子的碱基配对或互补的顺式重复序列来抑制反向剪接。剪接因子U2AF1结合EIB内的3‘剪接位点，U2AF1基因的突变会导致白血病细胞中整体circRNA水平升高以及同源线性基因表达的改变。值得注意的是，由RBP调控的反向剪接有时更为复杂，因为它并非单纯地促进或抑制。例如，HNRNPL结合circRNA形成外显子的侧翼内含子来调控反向剪接，敲低HNRNPL会导致139个circRNA显著增加和93个circRNA减少，而这些circRNA的同源mRNA水平保持不变。

RBP作为反式作用因子，因其能赋予circRNA生物发生以细胞、组织和疾病特异性（这是顺式元件无法单独决定的），从而引入了额外的复杂性层次。几个参与circRNA生物发生的反式因子与正常生理和人类疾病紧密相关。QKI能显著改变经历上皮-间质转化（EMT）的癌细胞中的circRNA谱，并且负责约30%的丰度circRNA的形成，这一过程在很大程度上不依赖于亲本mRNA的丰度。NOVA2的缺失会降低小鼠胚胎皮层中的整体circRNA水平，且这种降低与其线性对应物无关。尽管兴奋性和抑制性神经元中circRNA的表达模式广泛重叠，但NOVA2调控的circRNA在这两种细胞类型中大部分是不同的，表明NOVA2在调控circRNA生物发生方面具有神经元亚型特异性。ZC3H14在人和小鼠睾丸中高表达，其在小鼠中的缺失会导致精子发生缺陷和睾丸circRNA水平降低40%，且不依赖于mRNA表达和选择性剪接。此外，ZC3H14功能失调和circRNA生物发生与人类的非梗阻性无精子症（NOA）相关。circRNA水平可能受细胞增殖速率的影响，在解释hnRNPM和DHX9等反式因子在调控circRNA水平中的整体作用时应考虑这一点。

此外，遗传因素（如简单重复序列扩展和肿瘤性MYCN扩增）也与不同细胞类型和疾病中的circRNA生物发生相关。表观遗传因素，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA修饰，也调控circRNA水平。例如，编码CDR1as/ciRS-7的亲本基因LINC00632启动子区的DNA甲基化导致结肠腺癌中CDR1as/ciRS-7水平降低，而LINC00632启动子的去甲基化则强烈上调CDR1as/ciRS-7的表达。LINC00632启动子上的组蛋白H3 lysine 27三甲基化（H3K27me3）在黑素瘤细胞中抑制CDR1as/ciRS-7的表达，而组蛋白H3 lysine 9乙酰化（H3K9ac）在结肠肿瘤细胞中上调CDR1as/ciRS-7水平。最近一项研究表明，H3K27ac标记的超增强子能显著促进circRNA宿主基因的转录，并增加选择性环化和circRNA的多样性。有趣的是，H3K79me2在环化外显子侧翼的内含子区域高度富集，提示H3K79me2可能在circRNA生物发生中发挥作用。N6-甲基腺苷（m6A）作为一种主要的表观遗传RNA修饰，已显示可通过YTHDC1-DDX5轴促进横纹肌肉瘤细胞中一部分circRNA的生物发生。

ElciRNA中内含子保留的调控

ElciRNA是circRNA的一个亚类，其特征是同时包含外显子和内含子序列。除了调控环化的、已充分表征的反向剪接机制外，ElciRNA的生物发生还受circRNA中内含子保留的调控。深度学习模型揭示，与未在circRNA中保留的内含子相比，ElciRNA中保留的内含子更短、富含GC、与较弱的剪接位点相关，并且含有更高密度的几种RBP（包括SRSF1）的结合基序。一项全基因组CRISPR敲除（KO）筛选证明，SRSF1通过嘌呤富集基序结合ElciRNA的保留内含子并促进内含子剪接，从而抑制大多数ElciRNA的生物发生。在神经元分化过程中，SRSF1水平的下降与ElciRNA丰度的增加相关，并且SRSF1调控的ElciLIMK1可能通过LIMK1-磷酸化cofilin调控轴促进分化。这与分化过程中mRNA内含子保留的全局减少形成对比，后者与神经元活动相关，这凸显了ElciRNA独特的调控模式。尽管有这些见解，反向剪接和内含子保留在ElciRNA生物发生中的潜在协调作用仍然不清楚。此外，进化差异给ElciRNA的生物发生带来了额外的复杂性。例如，circCAMSAP1在人和小鼠细胞中都是高表达的circRNA，它在人脑中同时存在ecircRNA和ElciRNA两种亚型，而在小鼠脑中仅存在ecircRNA亚型。这强调了ElciRNA生物发生的物种特异性调控，值得进一步研究。

ciRNA形成的调控

内含子套索前体逃避去分支化并经历3‘尾修剪，形成稳定的内含子circRNA，即ciRNA。ciRNA的连接点由5’内含子末端和分支点（BP）核苷酸之间的2‘-5’磷酸二酯键组成。富集于细胞核的ciRNA通过与RNA Pol II延伸机制相互作用来促进亲本基因的表达。一些位于细胞质的ciRNA与癌症进展和内皮细胞衰老相关。ciRNA的生物发生既依赖于BP的选择，也依赖于序列上下文，这些因素可能干扰RNA去分支酶的活性或招募保护性因子，从而有利于环化。目前已发现几个促进ciRNA形成的保守顺式基序。例如，在人类ciRNAs中，5‘剪接位点附近的GU富集基序和BP附近的C富集基序是富集的。此外，具有非经典BP（C、G或U）的套索通常去分支效率较低，因此更可能积累并产生ciRNAs。DBR1是唯一已知的RNA去分支酶，它能水解分支点的2’-5‘磷酸二酯键，导致内含子套索线性化并抑制ciRNA的形成。需要进一步研究以确定更多参与ciRNA生物发生的反式因子，并扩展我们关于这些分子如何形成的知识。最近，共转录套索测序（CoLa-seq）使得能够在转录过程中捕获新生的套索，从而使得监测ciRNA生物发生成为可能。

mecciRNA的生物发生

与核基因组编码的circRNA相比，mecciRNA表现出独特的特征，例如快速降解。已有报道称几种mecciRNA可调控线粒体功能，包括核编码蛋白质的线粒体输入以及线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放以调节线粒体活性氧（mtROS）的释放。此外，越来越多的证据表明mecciRNA与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和心力衰竭（HF）等人类疾病密切相关。然而，mecciRNA的生物发生机制仍然知之甚少。对mecciRNA的分析显示，约50%的mecciRNA在环化序列的两侧存在8 nt重复序列，这使得起始/终止位点模糊不清。然而，由此产生的环状mecciRNA序列本身是准确且独特的。这一特征可能与mecciRNA的生物发生有关，需要更多探索。值得注意的是，在两个案例（mecciND1和mecciND5）中，用含有环化mecciRNA片段及其紧邻侧翼序列的质粒进行核转染，可在细胞和线粒体水平上导致mecciRNA的过表达。此外，大多数mecciRNA以及线性的线粒体mRNA、tRNA和rRNA都由线粒体重链编码，表明mecciRNA的生物发生可能与来自同一前体的经典线性线粒体转录本的生物发生存在竞争。

在高等真核生物中，普遍认为线粒体中不存在内含子和线性剪接事件。然而，在一些哺乳动物线粒体中发现了包括hnRNPM在内的几个核编码的剪接因子，它们可能调控线粒体线性RNA的加工。这些剪接因子也可能参与mecciRNA的生物发生。来源于线粒体轻链上COX2基因座的mecciRNA SCAR，可驱动代谢性炎症并作为NASH的治疗靶点。研究发现，hnRNPM通过结合SCAR前体的环化及侧翼序列来抑制SCAR的生物发生。

circRNA生物发生调控因子的研究方法

识别circRNA生物发生的潜在调控因子，一个常见策略是结合功能缺失或功能获得实验与高通量circRNA谱分析。这使得能够确定这些反式因子水平与整体circRNA丰度之间的相关性，然后通过进一步的实验数据和生物信息学分析来阐明分子机制。大多数已知的反式因子，如HNRNPL、FUS和hnRNPM，都是利用此策略被鉴定的。

此外，还设计了两种主要的报告系统，结合基于RNAi或CRISPR KO的筛选，来探索circRNA的生物发生。这两种报告系统都利用双荧光蛋白作为筛选和功能验证的输出。一种报告系统基于来源于多外显子基因的circRNA（ME-circRNA-reporter），其中反向剪接和线性剪接是耦合的。该报告系统能够同时监测来自同一前体RNA的环状和线性异构体，分别通过内部核糖体进入位点（IRES）驱动的GFP和RFP蛋白表达来反映。基于ME-circRNA-reporter的RNAi介导的筛选鉴定出QKI和ILF3，它们通过结合功能性内含子区域来促进circRNA生物发生。另一种系统基于来源于单外显子基因的circRNA（SE-circRNA-reporter），其中反向剪接的发生不伴随线性剪接。在该报告中，GFP蛋白由来自单外显子基因（如VN1R1）外显子序列侧翼的IRES驱动的circRNA翻译产生，RFP蛋白由另一个构建体表达作为内参。最近利用SE-circRNA-reporter结合全基因组CRISPR KO筛选，证明ZC3H14可促进circRNA生物发生。

ME-circRNA-reporter系统有效地捕获了反向剪接和线性剪接之间的竞争动态，这反映了RNA剪接过程中的生理耦合，而SE-circRNA-reporter系统则通过将反向剪接与线性剪接解耦联提供了独特优势，允许专门关注反向剪接的调控。后者特别适用于鉴定不依赖于circRNA侧翼内含子而起作用的因子。目前，这两种报告系统结合全基因组筛选正在培养细胞中使用。未来在小鼠或类器官模型中使用这些报告系统进行体内筛选将有助于鉴定更多细胞或组织特异性的调控因子。

体内和体外circRNA形成的生物医学相关性及应用

参与circRNA生物发生的各种反式因子以及失调的circRNA与人类疾病密切相关。U2AF1结合EIB中的3‘剪接位点以抑制circRNA的形成。U2AF1突变和circRNA水平升高在骨髓增生异常肿瘤中相对常见，并与不良预后相关。ADAR1是另一个可以抑制circRNA生物发生的RBP，它通过改变侧翼腺苷-尿苷（A-U）碱基对，从而破坏由反向互补序列形成的二级结构。最近一项研究表明，ADAR1和ADAR2通过依赖于A-to-I编辑和不依赖于编辑的机制，作为双向调控因子来促进或抑制一部分circRNA的生物发生。ADAR活性在不同类型癌症中调控circRNA水平至关重要。ZC3H14缺失会导致小鼠精子发生中断和睾丸circRNA水平降低。CircSry和circBoule的缺失与精子发生和精子缺陷有关，它们在睾丸中也受ZC3H14调控。一些参与circRNA生物发生的反式因子也参与关键circRNA的功能。例如，hnRNPM以序列依赖的方式与circURI1相互作用，调控选择性剪接，从而抑制胃癌转移。circRNA中内含子保留形成ElciRNA的调控也发挥着生理和病理作用。例如，ElciRNA circFhit在脊髓背角的GABA能神经元中表达，并通过与HNRNPK形成复合物促进Fhit转录来介导神经病理性疼痛。另一个ElciRNA，circRNF217，在硬骨鱼中通过miR-130-3p/NOD1轴增强先天抗菌反应。

基于circRNA生物发生的分子机制，已有几种策略被用来操纵细胞中单个circRNA的水平。降低特定circRNA生物发生最常用的方法是利用CRISPR/Cas9删除反向互补的基因组序列，例如circRNA侧翼内含子中的Alu或MIR重复序列。这种方法通常不影响其mRNA对应物。除了操纵侧翼内含子，突变circRNA EIB处的剪接位点不仅能阻止反向剪接以抑制circRNA形成，还可能影响线性剪接。删除同源3‘UTR中的ZC3H14结合基序可显著减少circRNA的产生而不改变mRNA水平。利用人工构建体异位过表达circRNA是一种关键方法，包含环化外显子及其近端侧翼区域约40至1000 nt反向重复序列的构建体可以实现显著的过表达。然而，这类载体通常导致circRNA过度表达，并产生可能干扰细胞生理的异常线性转录本。包含环化外显子、ZC3H14结合的EIB以及约300 bp最小侧翼内含子序列的小基因也能产生可观水平的circRNA；此外，将ZC3H14结合的3’UTR插入EIB小基因中可显著提高circRNA过表达效率。

circRNA已成为治疗人类疾病的有前景的平台。体外合成的编码或非编码circRNA正在被开发为药物，用于治疗病毒感染、NASH、HF和肿瘤等疾病，或作为疫苗来预防感染和肿瘤。一种工程化的可翻译成微蛋白UFD1s的circRNA，在缓解小鼠NASH进展方面具有医学价值。施用可促进mPTP关闭以规避mtROS释放的mecciND2，在小鼠HF模型中显示出保护作用。一种能引发有效中和抗体和T细胞免疫应答的circRNA疫苗，可在小鼠和猴子中提供针对SARS-CoV-2的有效保护。目前，circRNA的体外合成依赖于头对尾连接或自剪接核酶。前体线性RNA的头对尾连接由T4 DNA连接酶（带有DNA夹板）或T4 RNA连接酶以ATP依赖的方式进行介导。自剪接核酶，主要是I型内含子，是两种替代性circRNA工程方法的基础：置换内含子-外显子（PIE）系统和自靶向与剪接（STS）系统。PIE方法将融合在一起的环化外显子包裹在半内含子序列中。STS方法涉及将优化的I型内含子片段引入环化序列的5‘端。由PIE或STS产生的线性前体然后进行自剪接以产生circRNA。核酸连接酶介导的环化对于合成较短的circRNA（<100 nt）具有非常高的效率，而核酶方法对于较长的circRNA（>1000 nt）更有效。自剪接核酶介导的环化效率随着circRNA长度的增加而降低。展望未来，理解circRNA生物发生的机制可能有助于未来设计和体外合成circRNA药物和疫苗。

结语

不同circRNA亚型的生物发生、运输、细胞定位和降解是协调进行的，以确保circRNA的正常表达和功能，这些过程的失调与疾病密切相关。circRNA谱可能主要由其生物发生决定，因为大多数circRNA相对稳定。由于不同circRNA亚型具有 distinct 特征，对各类circRNA生物发生的进一步研究将为其多样性提供更多见解。circRNA生物发生在物种间的进化保守性是另一个需要研究的领域。尽管在不同circRNA亚型，特别是反向剪接调控的生物发生方面取得了显著进展，但仍有一些关键问题和挑战需要解决。例如，反向剪接和线性剪接是如何协调的？不同RBP调控反向剪接与线性剪接特异性的精确分子机制是什么？影响circRNA生物发生的顺式作用元件是如何进化的？这些顺式元件的进化保守性以何种方式与circRNA生物发生中的保守功能相耦合？调控circRNA生物发生的RBP有哪些结构或其他相似性？除了RBP，还有哪些变量参与circRNA生物发生的细胞和组织特异性调控？理解内源性circRNA的生物发生、代谢和功能如何促进体外合成circRNA的生物医学应用？

不同circRNA亚型的生物发生通过不同的机制受到调控，尽管有些RBP可以在不止一个亚型中发挥作用。例如，hnRNPM既抑制反向剪接，也抑制mecciRNA SCAR的形成。同样，不同circRNA亚型的生物发生和单个circRNA的功能性可能表现出时间、空间和细胞的异质性。由RBP和circRNA创造的动态调控网络需要更多研究。除了相对明确的反向剪接调控机制外，还需要对ElciRNA的内含子保留、ciRNA形成和mecciRNA生物发生进行更全面的研究。

合成circRNA在疾病治疗和预防方面显示出巨大潜力，但其临床应用面临多重挑战。目前，合成的外源性circRNA通常忽略了内源性circRNA分子的固有特性，例如可能的碱基修饰、二级和/或三级结构以及细胞定位。为此，详细理解circRNA生物发生所涉及的多种机制，可能有助于circRNA药物和疫苗的开发。