条形码狂犬病病毒追踪技术的开发与应用：实现单神经元全脑输入连接图谱的绘制

《Cell Reports Methods》：Development and application of a barcoded rabies viral tracing method for mapping brain-wide inputs to single neurons

本研究开发了一种条形码狂犬病病毒追踪（BRT）方法，通过结合高多样性条形码狂犬病病毒、单细胞RNA测序和批量条形码测序，成功绘制了内侧前额叶皮层（mPFC）神经元在单细胞分辨率下的局部和长程输入连接图谱。研究发现mPFC中存在高度异质性的输入模式，部分神经元接收异常多的局部输入，且局部输入数量与长程输入区域数量呈正相关。该技术为构建全面的中尺度连接组提供了重要工具。

　　

理解大脑功能的关键在于解析神经连接。虽然全脑连接组图谱已在宏观（神经束追踪）和微观（电子显微镜）尺度实现，但现有方法如同常规狂犬病病毒（RV）追踪或基于测序的投射图谱，无法在整合转录组身份的同时捕获单个神经元的局部和长程输入。此外，先前的条形码RV方法面临条形码在起始细胞间共享、条形码/细胞回收率低以及无法将连接与基因表达关联等挑战。

为了克服这些限制，研究人员开发了条形码狂犬病病毒追踪（BRT）方法。该方法将高多样性条形码狂犬病病毒与起始区域的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和全脑输入区域的批量条形码测序相结合，能够重建转录组定义的神经元的全面输入组。

在研究设计中，团队首先解决了起始细胞间条形码污染的关键问题。通过间隔24小时注射携带不同条形码的SAD狂犬病病毒，发现第二批次病毒的mRNA和基因组RNA丰度均显著降低，表明神经元优先扩增预先存在的病毒，这有效最小化了起始细胞间的条形码污染。此外，通过优化辅助病毒与狂犬病病毒的注射比例，将二级起始细胞（通过突触感染而非直接感染成为起始细胞）的比例控制在约8.5%。

BRT方法的核心是利用携带21个随机核苷酸条形码的CVS-N2c-ΔG-mRuby狂犬病病毒。将病毒注射到小鼠mPFC后，病毒从起始细胞逆向跨突触传播至其突触前输入神经元。9天后，分离起始区域进行scRNA-seq以获取条形码和转录组信息，同时从全脑切片中分离出聚集有荧光细胞的长程输入区域并进行批量条形码测序。通过严格的唯一性标准筛选条形码，并将起始细胞的条形码与其输入细胞/区域中检测到的条形码进行关联，从而重建每个起始细胞的输入连接图谱。

关键技术方法包括：使用高多样性条形码CVS-N2c狂犬病病毒进行逆向跨单突触追踪；对mPFC起始区域细胞进行单细胞RNA测序以获得转录组信息和细胞身份；对全脑多个输入区域进行批量条形码测序以鉴定长程输入来源；通过生物信息学分析关联条形码，构建单神经元分辨率的局部和全脑输入连接图谱。实验对象为2-3月龄C57BL/6J雄性小鼠。

分析mPFC神经元的局部连接

研究人员基于231个起始细胞和1,681个输入神经元重建了mPFC的局部神经环路。与群体水平研究一致，谷氨酸能神经元比GABA能神经元接收更多的平均输入数量。通过比较观察到的连接模式与随机预期，发现来自5/6层近投射（NP）神经元以及4/5层脑内（IT）神经元到2/3至5层兴奋性IT神经元的连接过度表征，而来自5层锥体束（PT）神经元、L6 IT神经元到4/5-5层IT神经元的连接则表征不足。此外，深层兴奋性神经元之间存在特定的连接模式，例如L6 IT神经元到5层神经元的连接表征不足，而L6皮质丘脑（CT）神经元到6层而非5层神经元的连接也表征不足。对突触汇聚的分析显示，L6 CT和L5/6 NP神经元之间在共同支配同一突触后神经元方面存在显著的正向偏好。

识别mPFC中的超支配神经元

研究发现mPFC中特定起始细胞接收异常多的输入细胞，而其他细胞接收的输入则少于随机预期。根据局部输入数量，神经元被分为三组：“小输入组”（0-1个局部输入，占30.9%）、“大输入组”（输入数量超过随机预期，占15.8%）和“中等输入组”（其余57%）。转录组分析显示，大输入组神经元中与突触功能相关的基因（如Iqsec2, Sorcs2）以及GTP酶调控活性相关的基因显著上调，提示这些神经元可能通过增强突触后调控来适应高水平的输入。

mPFC神经元的长程输入连接

长程输入分析表明，投射到mPFC神经元的主要脑区包括丘脑（TH）、前边缘和边缘下区（PL/ILA）、海马CA1、前扣带回皮层（ACA）和屏状核（CLA），分别有81.8%、75.3%、61.9%、58.5%和52.8%的起始细胞从这些区域接收输入。超过一半的神经元接收来自四个以上区域的输入，12%的神经元接收来自超过十个（共十一个）区域的输入，而20.7%的神经元主要仅从一两个区域接收输入，显示出特化的连接模式。条件概率分析揭示了几个脑区（如RSPv, Alv, NDB, BLA, RSPagl, ORB, CLA）之间存在高度的输入共现可能性，表明存在汇聚性输入网络。

局部与长程输入的相关性

一个关键发现是，每个输入组中局部输入细胞的数量与输入区域的数量之间存在显著的正相关。与具有中等或小局部输入大小的神经元相比，具有大局部输入大小的神经元接收的远距离输入区域显著更多。局部输入细胞数量、远距离输入区域数量以及在这些区域检测到的条形码计数之间也存在正相关。这表明局部环路复杂的神经元也倾向于整合更多样化的长程输入，可能在网络中充当信息整合的枢纽。

本研究开发的BRT方法成功整合了条形码N2c狂犬病病毒、scRNA-seq和批量条形码测序，实现了对单个神经元局部和全局长程输入的高效绘图。应用该方法于mPFC神经元，揭示了大脑突触网络组织的重要原理，包括超支配神经元的存在、局部突触连接模式的过度和不足表征，以及mPFC中局部和远处突触前输入大小之间的强正相关性。

该研究的局限性包括狂犬病病毒逆向跨突触追踪的效率问题，导致仅能标记一部分突触输入（估计回收了约12.1%的细胞）。此外，BRT方法缺乏起始细胞胞体位置的空间信息，也无法解析其树突亚结构。未来结合空间分辨转录组技术（如Stereo-seq或BARseq）有望提供更全面的空间连接信息。

尽管如此，BRT方法为获取详细的全脑输入组提供了强大工具，弥补了电子显微镜重建和常规狂犬病病毒追踪之间的空白。它揭示了mPFC神经元输入组在单细胞水平的显著异质性，并明确了具有特殊整合功能的枢纽神经元，为理解大脑信息处理机制提供了新的细胞基础。该方法为在未来构建更全面的脑中尺度连接组奠定了宝贵的基础。