一步法高效制备高多样性条形码狂犬病毒：神经环路追踪技术的重大突破

《Cell Reports Methods》：One-step approach producing barcoded rabies virus with optimized diversity

本刊推荐：为解决传统狂犬病毒(RV)生产流程繁琐、条形码多样性不足等问题，Tan等人开发了一种一步法生产EnvA假型化RVΔG的新策略。该方法将病毒拯救、扩增和假型化整合为单一流程，显著缩短了SAD-B19ΔG和CVS-N2cΔG毒株的生产时间至7-9天，并彻底消除了G蛋白包被病毒污染。研究表明，该方法制备的条形码病毒库多样性更高、分布更均匀，且其跨突触标记效率与传统方法相当，为高通量单细胞分辨率连接组学图谱绘制提供了可靠工具。

　　

要理解大脑如何工作，首先需要绘制出大脑中数十亿神经元之间复杂的连接图谱——这被称为连接组学。传统的电子显微镜技术虽然分辨率极高，但耗时耗力，难以应用于全脑尺度的研究。而工程化的狂犬病毒(Rabies Virus, RV)作为一种强大的工具，能够进行单神经元精度的跨突触追踪：它像一把特制的钥匙，只能感染那些同时表达了TVA受体和狂犬病毒G蛋白的“启动细胞”，然后借助G蛋白包装自己，逆向跨越突触，精准地标记出所有为这个“启动细胞”提供输入的“上游细胞”。然而，传统方法一次实验通常只能分析一个动物体内的一个启动细胞，严重限制了研究效率。

为了突破这一瓶颈，科学家们想到了给病毒带上“条形码”。想象一下，给每个病毒颗粒赋予一个独特的DNA序列作为身份标识，当这些带有不同条形码的病毒感染神经元后，通过检测这些条形码，就能在一次实验中同时追溯成千上万个神经元的连接关系，极大地提高了研究通量。这就是条形码狂犬病毒的宏伟蓝图。然而，理想很丰满，现实却很骨感。传统的病毒生产方法通常步骤繁琐，包括病毒拯救、扩增和假型化等多个阶段，整个过程可能长达数周。更重要的是，在病毒扩增过程中，某些带有特定条形码的病毒可能会被过度复制，导致最终的病毒库中条形码分布极不均匀，多样性有限。这就好比印制了100万种不同编号的票券，但其中90%都是同一个号码，这样的票券系统根本无法有效区分不同的参与者。此外，生产过程中还可能混入未被正确假型化的G蛋白包被病毒，这些“违规”病毒会直接感染细胞，而不需要TVA受体，从而破坏了单神经元特异性追踪的根基。

针对这些挑战，来自临港实验室的徐华泰团队在《Cell Reports Methods》上发表了一项创新性研究，他们开发了一种名为“一步法”的新策略，旨在彻底优化条形码狂犬病毒的生产流程。该方法最核心的革新在于将病毒拯救、扩增和假型化这三个传统上独立的步骤整合到了一个统一的系统中。研究人员使用了经过改造的BHK-EnvA细胞（这种细胞表达了嵌合包膜蛋白EnvA），并通过电转染的方式，一次性将包含条形码的狂犬病毒基因组（RVΔG）以及病毒复制所需的N、P、L蛋白、EnvA蛋白和TVA受体的编码质粒导入细胞。在这个精心设计的“微型工厂”里，最初被拯救出的病毒颗粒表面包裹着EnvA蛋白，它们只能感染周围同样表达了TVA受体的邻近细胞。病毒就这样在表达TVA的细胞群中“接力”传播，实现了有限的、可控的扩增，而无需引入额外的G蛋白。这不仅将SAD-B19ΔG毒株的生产时间从传统的13-22天缩短到了7-8天，将CVS-N2cΔG毒株的生产时间缩短到8-9天，更重要的是，它从根本上杜绝了G蛋白包被病毒的污染，并且由于避免了病毒的大量、无限制扩增，使得最终获得的病毒库中条形码的分布更加均匀，多样性也显著提高。

为了开展这项研究，作者团队主要依赖了几项关键技术。首先是高效的细胞电转染技术，通过优化电转参数，大幅提高了病毒基因组的导入效率和病毒拯救的成功率。其次是利用稳定表达特定蛋白（如EnvA）的细胞系（BHK-EnvA细胞）作为病毒生产的平台。第三是分子克隆技术，用于构建包含高复杂度随机条形码序列的狂犬病毒基因组质粒库。第四是病毒滴度测定技术，通过感染表达TVA受体的HEK-293T细胞来精确量化有感染活性的病毒颗粒数量。最后是高通量DNA测序技术，用于对病毒基因组中的条形码序列进行深度测序，从而准确评估病毒库的多样性和均匀性。研究中使用的实验动物为C57BL/6J雄性小鼠。

结果

一步法生产狂犬病毒

本研究开发的一步法显著简化了假型化狂犬病毒的生产流程。与传统的三步法或两步法相比，该方法将病毒拯救、扩增和EnvA假型化整合到一个步骤中。其关键是在BHK-EnvA细胞中，通过电转染同时导入RVΔG基因组、辅助质粒（编码N、P、L蛋白）以及pCAG-EnvARGCD和pCAG-TVA质粒。拯救出的EnvA假型化病毒能够通过TVA受体感染邻近细胞，实现有限扩增，而无需引入G蛋白，从而避免了G蛋白包被病毒的污染。通过系统优化电转染条件，该方法在SAD-B19ΔG-BFP病毒生产中，第5天病毒滴度达到(3.1±0.08) x 10⁴IU/mL，第7天升至(1.32±0.15) x 10⁵IU/mL，浓缩后滴度约为(8.65±4.8) x 10⁷IU/mL。对于CVS-N2cΔG-mRuby病毒，第5天滴度为(3,527±607) IU/mL，第6天显著增加至(1.66±0.12) x 10⁴IU/mL并保持稳定，浓缩后最终滴度为(2.47±0.47) x 10⁷IU/mL。该方法将SAD毒株的生产时间缩短至7-8天，CVS-N2c毒株缩短至8-9天。

一步法与常规方法具有相当的跨突触标记效率

为了评估一步法所产病毒的跨突触标记效率，研究人员将一步法生产的SAD-B19ΔG-BFP- Barcode病毒与两步法生产的SAD-B19ΔG-GFP-Barcode病毒调整至相同滴度后，共同注射到小鼠下丘脑外侧区(LHA)。通过定量分析各个脑结构中输入细胞的比例，发现BFP（一步法）和GFP（两步法）标记的细胞比例高度一致，无显著差异，表明一步法生产的病毒在跨突触追踪效率上与传统方法相当。进一步，将一步法生产的CVS-N2cΔG-mRuby-Barcode病毒与SAD-B19ΔG-BFP-Barcode病毒共同注射后，结果显示CVS-N2cΔG-mRuby病毒标记的输入细胞比例显著高于SAD-B19ΔG-BFP病毒，尤其是在新皮层和海马区，分别增加了约4.37倍和4.89倍，证实了一步法生产的CVS-N2cΔG病毒依然保持了其增强的跨突触传播能力。虽然一步法获得的病毒滴度较低，会导致标记的启动细胞和输入细胞总数减少，但对每个启动细胞对应的输入细胞数量（即连接比例）没有影响。

一步法提高条形码多样性和均匀性

条形码狂犬病毒的应用前景取决于其病毒库中条形码的多样性和均匀性。本研究对一步法、两步法和三步法生产的条形码病毒库进行了比较。通过对病毒基因组RNA进行逆转录PCR和高通量测序分析条形码序列，发现一步法生产的病毒库在条形码多样性和均匀性上均有显著提升。一步法病毒库中最高丰度的条形码占比更低，且当抽样一定数量的病毒颗粒时，一步法库中独特条形码的比例远高于传统方法生产的库。此外，将两个独立批次生产的一步法病毒库合并后，发现条形码重叠率极低（仅3.6%），且高丰度条形码并未在两个批次中均出现，表明合并多个独立生产的批次是进一步扩大病毒库总多样性的有效策略。

一步法生产条形码CVS-N2cΔG

CVS-N2c毒株因其更强的跨突触传播能力和较低的神经元毒性，在神经环路追踪中更具优势。本研究成功将一步法应用于条形码CVS-N2cΔG病毒的生产。尽管单个批次的CVS-N2cΔG病毒库的多样性和均匀性略逊于SAD-B19ΔG，但一步法生产周期短的优势使得在一个月内连续生产八个独立批次成为可能。每个批次平均包含7,034±680个独特条形码。将这八个批次的病毒混合后，通过线性模型估算，混合病毒库包含了高达55,935个独特条形码，其中丰度最高的条形码仅占0.16%。当模拟抽样1,000个病毒颗粒时，预计有87.1%的条形码是唯一的，这为大规模神经元追踪提供了高质量的条形码资源。

讨论与结论

本研究开发的一步法通过电转染技术高效地将病毒基因组导入BHK-EnvA细胞，并将病毒拯救、扩增和假型化过程整合，利用细胞瞬时表达TVA受体和稳定表达EnvA蛋白的特性，实现了病毒的可控性扩增。这种方法虽然导致最终病毒滴度低于传统方法，但恰恰是这种有限的扩增避免了某些条形码的过度放大，从而显著提高了条形码库的均匀性和多样性。同时，该方法彻底避免了G蛋白的引入，根除了G蛋白包被病毒的污染风险，保障了基于狂犬病毒的单神经元特异性追踪的可靠性。

对于CVS-N2cΔG毒株，一步法生产仍面临拯救效率较低和批次间差异较大的挑战。未来可通过构建稳定表达T7 RNA聚合酶和EnvA的细胞系，或采用具有更高自切割活性的核酶（如优化后的HDV核酶）来提升拯救效率。本研究的体内实验证实，一步法生产的CVS-N2cΔG病毒在不同脑区展现出差异性的跨突触标记增强效应，特别是在皮层区域提升最为显著，这可能与不同输入脑区与启动脑区之间的突触汇聚程度或神经元亚型特性有关。

总之，Tan等人报道的一步法为快速、高效地生产高质量条形码狂犬病毒提供了一种革新性解决方案。它极大地简化了生产流程，缩短了时间，并从根本上解决了G蛋白污染和条形码库质量不佳的核心难题。尽管病毒滴度较低可能限制其在常规非条形码病毒追踪中的应用，且CVS-N2cΔG毒株的拯救效率仍有提升空间，但该方法在生成高多样性、高均匀性条形码病毒库方面的卓越表现，使其成为推动高通量单细胞分辨率连接组学发展的有力工具，为解析大脑复杂神经网络结构提供了新的强大武器。