系统性解析DNASE1L3缺陷小鼠肝脏免疫代谢紊乱的多组学图谱

《iScience》：Systematic profiling reveals hepatic immune and metabolic dysregulation in DNASE1L3-deficient mice

本研究针对DNASE1L3在肝脏免疫代谢调控机制不清的科学问题，通过构建DNASE1L3基因敲除小鼠模型，结合多组学分析技术，揭示了该酶缺陷通过激活DAMP-PRR信号通路、诱发内质网应激和铁死亡，导致自发性肝脂肪变性的新机制。该研究为核酸驱动的免疫代谢失调在慢性肝病中的作用提供了理论框架，为NAFLD的防治提供了新靶点。

　　

在当今全球范围内，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)已成为一个日益严重的公共卫生问题，其发病机制复杂，涉及脂质代谢紊乱、炎症反应和免疫细胞功能失调等多个环节。尽管已知肝内巨噬细胞——Kupffer细胞(KC)在维持肝脏免疫代谢平衡中发挥关键作用，但调控其功能的核心分子机制仍不清楚。DNASE1L3(脱氧核糖核酸酶1类似物3)作为一种主要由单核-巨噬细胞系分泌的核酸酶，在降解凋亡或坏死释放的细胞游离DNA(cfDNA)和维持免疫耐受中起重要作用。然而，DNASE1L3在肝脏这一免疫代谢中枢器官中的具体功能，特别是其缺陷是否以及如何参与NAFLD的发生发展，尚待深入探究。

为解决这一科学问题，天津医科大学总医院普通外科刘权彦教授团队在《iScience》上发表了最新研究成果。研究人员通过构建全身性DNASE1L3基因敲除(KO)小鼠模型，结合免疫表型分析和多组学技术(包括转录组学、蛋白质组学、代谢组学和全基因组重测序)，系统揭示了DNASE1L3缺陷导致肝脏免疫代谢紊乱的分子机制。

研究采用的关键技术方法包括：流式细胞术分析骨髓造血祖细胞和肝内免疫细胞亚群；RNA测序分析肝组织和Kupffer细胞的转录组变化；TMT标记的定量蛋白质组学分析肝组织蛋白表达谱；非靶向代谢组学分析肝内代谢物变化；全基因组重测序检测基因突变；以及免疫组织化学和Western blot验证关键分子表达。所有实验均使用C57BL/6背景的野生型(WT)和DNASE1L3敲除(KO)小鼠。

DNASE1L3缺陷损害髓系祖细胞分化并诱导自发性肝脂肪变性

研究人员首先发现，8周龄DNASE1L3敲除小鼠骨髓中共同髓系祖细胞(CMP)频率显著降低，而粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)和巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP)无显著变化，表明DNASE1L3特异性影响髓系分化早期阶段。脾脏单核细胞亚群分析显示，KO小鼠经典单核细胞减少而非经典单核细胞增加，同时脾巨噬细胞增多，提示髓系分化向巨噬细胞倾斜。值得注意的是，50周龄KO小鼠出现体重显著增加、肝肿大和明显的肝脂质积聚，组织学分析显示广泛的巨泡性脂肪变性，表明DNASE1L3缺陷可在无饮食诱导情况下自发导致NAFLD样表型。

转录组分析揭示DNASE1L3缺陷肝脏中DAMP信号激活和促炎基因特征

对8周龄小鼠肝组织的转录组分析发现554个差异表达基因(255个上调，299个下调)。GO富集分析显示上调基因与核酸处理、急性期反应和金属离子应答等炎症和代谢应激相关通路相关。GSEA分析表明NOD样受体和Toll样受体信号通路显著富集，提示模式识别受体(PRR)激活。qPCR验证显示KO肝脏中Nlrp3、Tlr4和Zbp1等DAMP/PRR相关基因表达上调。免疫组化进一步证实KO肝脏中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达增加且出现胞质转位，同时肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和F4/80等炎症介质表达升高，表明DNASE1L3缺陷肝脏已建立促炎性程序。

DNASE1L3缺陷诱导Kupffer细胞促炎极化和免疫代谢重编程

研究人员进一步探究了DNASE1L3缺陷对Kupffer细胞的影响。流式细胞术分析显示，LPS刺激后KO小鼠Kupffer细胞中M1极化比例显著增加，而IL-4诱导的M2极化减少。RNA测序分析发现，KO来源的Kupffer细胞在M1极化条件下，NOD样受体信号通路、TNF信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等炎症通路显著激活。同时，脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢等代谢通路也发生改变，表明Kupffer细胞存在免疫激活与代谢重编程的协同变化。

DNASE1L3缺陷诱导Kupffer细胞内质网应激并协调炎症和代谢失调

机制上，研究人员发现DNASE1L3缺陷导致Kupffer细胞中内质网应激相关通路激活。qPCR分析显示，未折叠蛋白反应(UPR)的三个主要分支——PERK通路下游效应因子ATF4、ATF6分支以及IRE1-XBP1通路均显著激活，CHOP和XBP1剪接体表达增加。这些结果表明DNASE1L3缺陷可能通过诱导内质网应激，将炎症激活与能量代谢联系起来，形成正反馈循环。

DNASE1L3缺陷诱导肝脏氧化还原失衡和铁死亡相关代谢重编程

代谢组学分析显示，KO小鼠肝脏代谢物发生广泛改变，包括脂肪酸代谢中间体、谷胱甘肽合成前体、芳香氨基酸衍生物和胆汁酸相关化合物等。KEGG富集分析发现差异代谢物显著富集于脂肪酸生物合成、谷胱甘肽代谢、铁死亡和氧化磷酸化等通路。流式细胞术检测证实KO肝脏活性氧(ROS)水平显著升高，免疫组化显示铁死亡抑制酶GPX4表达下降而脂质过氧化标志物4-HNE积累增加，表明DNASE1L3缺陷导致肝脏氧化应激和铁死亡易感性。

蛋白质组学分析揭示DNASE1L3缺陷小鼠肝脏代谢重编程和铁死亡通路激活

蛋白质组学数据验证了转录组和代谢组学结果，发现差异表达蛋白广泛分布于细胞质、细胞核、内质网和线粒体等亚细胞结构。脂代谢通路中，脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)等关键酶表达下调，而脂肪酸氧化酶ACOX1和脂质摄取蛋白CD36表达上调。同时，内质网应激传感器IRE1α上调，而参与蛋白质折叠和氧化还原缓冲的伴侣蛋白表达下降。铁死亡相关蛋白中，促铁死亡酶ACSL4上调而抗铁死亡酶GPX4下调，铁储存蛋白FTH1和FTL表达增加，进一步支持DNASE1L3缺陷导致铁死亡激活。

DNASE1L3缺陷诱导全基因组广泛突变和小鼠染色体4特异性突变聚集

全基因组重测序发现，DNASE1L3缺陷小鼠基因组中存在约225万个单核苷酸多态性(SNP)和38万个插入/缺失(INDEL)，其中4号染色体表现出高突变密度和明显聚类。功能富集分析显示这些突变区域包含与脂代谢、氧化应激、铁稳态和炎症相关的蛋白编码基因，表明DNASE1L3缺陷可能通过损害DNA降解功能，同时促进cfDNA驱动的免疫激活和基因组不稳定性。

研究结论表明，DNASE1L3作为肝脏免疫代谢稳态的关键调控因子，其缺陷通过cfDNA-PRR-Kupffer细胞轴引发先天性免疫激活、代谢重编程、内质网应激、铁死亡和基因组不稳定性，最终导致NAFLD进展。这一机制框架不仅拓展了DNASE1L3 beyond其经典核酸酶功能的认识，也为免疫代谢亚型NAFLD的治疗提供了潜在靶点。

该研究的创新之处在于提出了一个完整的病理级联反应模型：DNASE1L3缺陷导致cfDNA积累，激活PRR信号和Kupffer细胞M1极化，诱发内质网应激和氧化还原失衡，最终通过铁死亡途径驱动肝脂肪变性。与以往主要关注肝细胞内在机制的研究不同，该研究强调了先天免疫调控作为NAFLD起始因素的重要性，为理解疾病异质性和开发针对性治疗策略提供了新视角。

然而，研究也存在一定局限性，如使用全身性敲除模型难以完全排除系统性影响，缺乏Kupffer细胞特异性敲除模型验证细胞自主性作用，以及未通过DNASE1L3补充或PRR抑制实验直接证明因果关系。这些局限也为未来研究指明了方向，包括利用细胞特异性敲除模型、开展功能性挽救实验以及探索性别因素对表型的影响等。

总之，这项研究通过多组学整合分析，系统阐明了DNASE1L3在维持肝脏免疫代谢平衡中的关键作用，不仅深化了对NAFLD发病机制的理解，也为开发针对核酸驱动免疫代谢失调的干预策略奠定了理论基础。