SARS-CoV-2非结构蛋白1通过降低RNA聚合酶II水平抑制宿主转录的新机制

《iScience》：SARS-CoV-2 nonstructural protein 1 suppresses host transcription by reducing RNA polymerase II levels

本刊推荐：为阐明SARS-CoV-2 NSP1蛋白在宿主基因转录层面的调控作用，研究人员构建了NSP1过表达细胞模型，结合SLAM-seq与ERCC spike-in标准化技术，首次揭示NSP1通过降低RNA聚合酶II（Pol II）蛋白水平全局抑制宿主新生RNA合成。该研究为理解冠状病毒免疫逃逸机制提供了新视角，并为开发靶向NSP1的抗病毒策略奠定了理论基础。

　　

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情给全球公共卫生和社会经济带来了深远影响。尽管随着疫苗接种和抗病毒疗法的推进，全球健康危机已逐步缓解，但深入理解SARS-CoV-2与宿主细胞的相互作用机制，对于阐明COVID-19的致病机理以及应对未来类似冠状病毒的爆发至关重要。SARS-CoV-2编码的16个非结构蛋白（Nonstructural Proteins, NSPs）在病毒复制和宿主免疫逃逸中扮演关键角色。其中，非结构蛋白1（NSP1）被公认为主要的病毒关闭因子，以其强大的抑制宿主基因表达的能力而闻名。以往研究主要集中在NSP1通过招募细胞核酸酶或干扰RNA稳定性通路，导致宿主mRNA广泛降解，从而抑制宿主蛋白合成。然而，NSP1是否以及如何影响宿主基因的转录过程，即mRNA的合成源头，仍然是一个悬而未决的科学问题。在细胞内，mRNA的水平由其转录合成和降解速率共同决定。在NSP1导致mRNA剧烈降解的背景下，传统的仅检测总RNA丰度的转录组测序（RNA-Seq）方法难以准确区分转录抑制和降解增强各自的贡献。因此，迫切需要创新性的研究策略来精确揭示NSP1在转录层面的调控功能。

为了解决这一难题，来自广州国家实验室基础研究部的李建芳、王康、王杰、钟才周、王圣岚、彭红和李铮研究员团队在《iScience》上发表了他们的最新研究成果。研究人员开展了一项整合多种前沿技术的系统性研究，旨在精确量化NSP1对宿主转录活动的影响。为了开展研究，作者主要应用了以下几种关键技术：首先，构建了包含SARS-CoV-2 5‘端前导序列的NSP1过表达质粒，并利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分离转染成功的细胞，确保了实验材料的纯度。其次，创新性地将4-硫尿苷（4sU）代谢标记技术（SLAM-seq）与外参RNA控制联盟（ERCC） spike-in标准化相结合，从而能够并行、精确地定量细胞中的总RNA和新生RNA。此外，还采用了RNA聚合酶II CUT&Tag测序技术、蛋白质稳定性分析（使用CHX和MG132）、免疫共沉淀（Co-IP）、EU（5-乙炔基尿苷）掺入实验、RT-qPCR、Western blot、免疫荧光以及活细胞报告基因系统（ACTB-P2A-mCherry-mODC1）等多种分子和细胞生物学方法进行机制探索和验证。

Establishment of NSP1 overexpressed cells

研究人员首先成功构建了带有Flag标签的NSP1及其核糖体结合缺陷突变体NSP1-KH（K164A/H165A）的表达质粒。为了克服NSP1自身对其表达的抑制，他们巧妙地在NSP1编码序列上游加入了SARS-CoV-2的5‘端前导序列，从而实现了NSP1在H1299细胞中的稳定高效表达。免疫荧光实验发现NSP1不仅定位于细胞质，也存在于细胞核内，这提示了其可能具有调控核内转录的功能。

NSP1 impeded the expression of housekeeping genes

通过FACS分选eGFP阳性的转染细胞，研究人员发现，在混合细胞群体中，看家基因GAPDH和ACTB的mRNA水平变化不明显，但在纯化的NSP1表达细胞中，这两个基因的mRNA水平显著下降。这表明，只有通过精确分选，才能排除未转染细胞的干扰，真实反映NSP1的转录抑制效应。

A novel strategy to investigate NSP1-mediated transcriptional repression in host cells

本研究最核心的创新在于建立了一套全新的分析流程。该流程结合了FACS分选、4sU标记和ERCC spike-in标准化。研究人员发现，在NSP1表达细胞中，由于内源性mRNA被大量降解，测序数据中来源于ERCC spike-in的reads比例显著升高。分别使用传统的测序深度标准化和ERCC spike-in标准化进行差异基因分析，得到了截然不同的结果。ERCC标准化结果显示，与空载体对照相比，NSP1过表达细胞中有成千上万个基因被显著下调，而上调基因寥寥无几。而传统标准化方法则严重低估了下调基因的数量，并错误地显示大量基因上调。RT-qPCR验证证实ERCC标准化的结果更为准确，凸显了在存在全局性mRNA降解的系统中使用外参进行标准化的重要性。

NSP1 repressed the host cell mRNA abundance

基于ERCC标准化的转录组分析表明，NSP1导致了宿主细胞mRNA丰度的全局性降低。超过9000个基因的表达被抑制，其中约76%的基因在三个不同的4sU标记时间点均一致下调。基因本体（GO）富集分析显示，参与蛋白质折叠、糖基化以及甲基化过程的基因被显著抑制，这提示NSP1可能通过降低这些关键过程相关基因的表达，破坏内质网蛋白质质量控制和组织相容性复合体I类（MHC-I）抗原呈递，从而助长病毒免疫逃逸。

NSP1 protein impeded the synthesis of nascent mRNA in host cells

通过分析SLAM-seq数据中的新生RNA部分，研究人员直接评估了转录活性。他们发现，NSP1表达细胞不仅预存RNA减少，新生RNA的绝对量也显著降低。EU掺入实验进一步直观地显示NSP1表达细胞中新合成RNA的信号减弱。对mRNA动力学的计算表明，NSP1既缩短了转录本的半衰期（促进降解），也降低了其合成速率（抑制转录）。对新生RNA差异表达基因的分析再次富集到了甲基化相关基因和RNA聚合酶通路。

NSP1 reduces RNA polymerase II levels and suppresses host transcription

机制探索表明，NSP1表达细胞中多个RNA聚合酶II（Pol II）亚基（如POLR2A, POLR2B等）的mRNA和蛋白水平均显著降低。Pol II CUT&Tag测序显示，在NSP1表达细胞中，Pol II在全基因组范围内的结合信号减弱。进一步分析发现，约70%新生RNA下调的基因也伴随有Pol II结合的减少。免疫共沉淀实验表明NSP1并不直接与Pol II相互作用。蛋白质稳定性实验发现，在蛋白质合成抑制剂CHX处理下，Pol II的降解速度比看家蛋白β-actin更快；而在蛋白酶体抑制剂MG132存在下，Pol II/β-actin的比值会上升，说明Pol II的合成速率超过β-actin，但其本身更容易通过泛素化-蛋白酶体途径被降解。这些结果提示，NSP1并非直接降解Pol II，而是可能通过抑制Pol II自身的转录和翻译，并加剧其通过蛋白酶体途径的周转，最终导致Pol II蛋白水平的下降。最后，利用构建的ACTB-P2A-mCherry-mODC1活细胞报告系统，研究人员证实NSP1能够抑制ACTB的转录和/或翻译，导致快速降解的mCherry荧光信号减弱，为NSP1的双重抑制功能提供了功能性证据。

该研究得出结论，SARS-CoV-2的NSP1蛋白采用了一种双重打击策略来关闭宿主基因表达。除了其已知的通过促进mRNA降解和抑制翻译来影响转录后过程的功能外，本研究首次揭示NSP1还能通过降低RNA聚合酶II（Pol II）的蛋白水平，从源头上全局性抑制宿主基因的转录。这种对转录机制的破坏，特别是对甲基化相关基因和先天免疫基因转录的抑制，为解释SARS-CoV-2有效抑制宿主早期免疫应答、实现免疫逃逸提供了新的分子机制。这项研究的意义重大。首先，它更新了我们对NSP1功能的认识，揭示了其作为转录抑制因子的新角色。其次，研究所建立的结合SLAM-seq和ERCC spike-in标准化的方法学框架，为研究其他病毒因子或条件下面临全局性RNA丰度变化的转录调控提供了强大工具。最后，该研究指出Pol II稳定性调控通路和NSP1本身可作为潜在的抗病毒治疗靶点。由于NSP1在多种冠状病毒中相对保守，针对NSP1的开发策略可能不仅对SARS-CoV-2有效，也有望应用于应对未来新发冠状病毒的威胁。当然，研究也存在局限性，例如在真实的病毒感染过程中，其他病毒蛋白可能对NSP1的效应有调制作用，这需要在未来的BSL-3条件下用活病毒进行更接近生理状态的验证。