假单胞菌来源新型PCL降解酶的双向催化功能：降解与开环聚合的绿色循环

《iScience》：Degradation and ring-opening polymerization of poly(ε-caprolactone) by a novel enzyme from Pseudomonas sp. DS0801

本刊推荐：针对聚己内酯(PCL)自然降解缓慢(3-4年)和化学合成存在金属催化剂残留的问题，研究人员从Pseudomonas sp. DS0801中纯化获得新型PCL降解酶PCLase0801。该酶不仅能高效降解PCL为单体/寡聚体，更可逆向催化ε-己内酯开环聚合，在45°C温和条件下8小时即可合成分子量6050 g/mol的PCL，其热稳定性(初始分解温度250°C)和结晶度(84%)优异，为塑料循环经济提供了酶法解决方案。

　　

随着全球环保意识的觉醒，可生物降解塑料逐渐成为解决白色污染的希望之光。在众多可降解聚酯材料中，聚己内酯(PCL)因其优异的加工性能、低熔点、生物可降解性和生物相容性，在生物医学和生态领域展现出巨大应用潜力。然而理想很丰满，现实却很骨感——研究表明PCL在自然环境中完全降解需要耗时3-4年，这种缓慢的降解速度远远不能满足实际需求。更令人担忧的是，PCL的降解效率受到pH值、温度、光照等多种环境因素的制约，使得其"可降解"特性大打折扣。

与此同时，PCL的传统化学合成方法也面临严峻挑战。化学聚合通常需要在150-280°C的高温下进行，并使用有机金属催化剂，这些催化剂可能残留有毒物质，限制了PCL在生物医学等敏感领域的应用。面对降解缓慢和合成污染这双重困境，科学家们开始将目光投向自然界中存在的生物催化剂——酶。

在这一背景下，东北师范大学生命科学学院的Di Yao等研究人员在《iScience》上发表了他们的最新发现。他们从活性污泥中分离到一株能够高效降解PCL的细菌Pseudomonas sp. DS0801，并从其培养液中成功纯化出一种具有双重催化功能的新型酶制剂。这一发现不仅为PCL的高效降解提供了新方案，更开创了酶法合成PCL的新路径，有望实现PCL的绿色循环利用。

研究人员主要采用了蛋白质纯化技术、酶学性质表征、质谱分析、扫描电镜观察、核磁共振检测、热分析技术以及酶催化聚合等方法。其中从菌株发酵液到获得高纯度酶的纯化过程涉及多步色谱分离，而对酶催化产物的分析则综合运用了现代仪器分析手段。

Purification and PCL degradability of the purified enzyme

研究人员通过DEAE Sepharose Fast Flow和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow两步色谱法，从Pseudomonas sp. DS0801的培养上清液中纯化得到分子量为30.4 kDa的PCL降解酶，命名为PCLase0801。SDS-PAGE分析显示酶达到电泳纯，浊度降低实验证实该酶能有效降解PCL乳液，而热灭活酶组则无此效果。

Enzymatic properties of PCL-degrading enzyme

酶学性质研究表明，PCLase0801的最适作用温度为40°C，最适pH为8.0，在50°C以下保持4小时稳定性，在pH 6.0-9.0范围内24小时后仍保留80%以上活性。金属离子影响实验显示K⁺和Mn²⁺对酶活性有促进作用，而Cu²⁺、10 mM Fe²⁺和10 mM Fe³⁺则显著抑制酶活。值得注意的是，该酶对有机溶剂表现出良好耐受性，即使在10%浓度的甲醇、乙醇和甘油中仍保持较高活性。

Substrate specificity of PCLase0801

底物特异性分析发现，PCLase0801能有效降解PCL和甘油三酯类底物，但对PHB(聚羟基丁酸酯)和PLA(聚乳酸)无活性。酶在长链底物(p-硝基苯酯C₂-C₁₆)上活性更高，提示其可能属于脂酶家族。质谱鉴定和序列比对证实该酶与Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌)的脂酶有99.99%的同源性。

Hydrolysis products analysis of PCLase0801

质谱分析揭示了PCLase0801的降解机制：酶作用后检测到单体(m/z 130.9)、二聚体(m/z 245.2)和三聚体(m/z 359.4)，表明酶能切割PCL链中的酯键，生成不同聚合度的产物。

Degradation process and SEM analysis of the films

PCL薄膜降解实验显示，酶处理6天后薄膜重量损失超过73%，降解过程分为缓慢期(0-2天)和快速期(2-6天)两个阶段。扫描电镜观察发现，未降解的PCL薄膜表面光滑，而随着降解的进行，表面出现明显侵蚀、粗糙度增加和裂纹加深的现象。

Enzymatic polymerization of ε-caprolactone by PCLase0801

最具创新性的发现是PCLase0801能催化ε-己内酯的开环聚合，在正己烷系统中单体转化率达到72.75%。此外，该酶还能催化二元醇与二元酸的缩聚反应，展示了比以往报道更广泛的聚合能力。反应条件优化表明，最佳聚合体系为：45°C、8小时、25 mg酶粉、水活度0.11。

Characterization of the structure of polymerized PCL

对酶法合成PCL的结构表征证实了产物的化学特性：¹H NMR显示PCL特征氢原子分裂峰，FT-IR在1731.2 cm^-1处显示C=O伸缩振动峰，2936.3 cm^-1为C-H键伸缩振动，3434.9 cm^-1确认羟基存在，验证了线性聚合物链的形成。

Properties of the polymerized PCL

酶法合成PCL的数均分子量(M_n)为6050 g/mol，重均分子量(M_w)为11074 g/mol，分子量分布(PDI)为1.7024，表明分子量分布相对均匀。热分析显示产物熔点51.62°C，熔融焓(ΔH_m)111.3 J/g，结晶度高达84%，初始分解温度250°C，完全热降解发生在460°C。偏光显微镜观察证实酶法合成PCL具有结晶能力，球晶尺寸与商业PCL相似。

Mechanistic insights into PCLase0801 function

结构建模显示PCLase0801由"核心"结构域(残基26-134和190-311)和"帽"结构域(残基135-189)组成，催化三联体为Ser108、Asp255和His277。基于脂酶作用机制，推测Ser108在His277辅助下通过亲核攻击和质子转移催化四面体中间体和酰基-酶复合物的形成与分解，最终实现PCL降解和游离羧酸的释放。聚合机制则涉及酶与内酯形成复合物，催化开环生成酰基-酶中间体，引发剂亲核攻击产生ω-羟基羧酸，其末端羟基进一步攻击活性单体，延长聚合物链。

研究结论表明，PCLase0801作为一种新型双功能酶，不仅能够高效降解PCL塑料，还能在温和条件下催化ε-己内酯的开环聚合，实现从塑料废弃物到新材料的绿色循环。与传统化学方法相比，酶法合成避免了金属催化剂残留问题，特别适合生物医学应用。该酶在有机溶剂中的稳定性和较低的最适反应温度，为其工业应用提供了显著优势。尽管研究在异源表达和酶固定化方面存在局限，但这一发现为塑料循环经济提供了新思路，展示了生物催化剂在解决塑料污染和绿色合成中的巨大潜力。