斑马鱼初级运动神经元亚型特异性转录组图谱揭示轴突路径选择的分子基础

《iScience》：Single-cell transcriptomic profiling of zebrafish primary motor neurons reveals subtype-specific gene expression signatures

本研究通过单细胞转录组测序技术，首次系统绘制了斑马鱼初级运动神经元（pMN）亚型特异性基因表达谱。研究人员利用Tg(mnx1:gfp)转基因胚胎分离运动神经元，鉴定出7个pMN亚群并构建分化轨迹，发现RoP、MiP和CaP亚型表达独特的转录因子组合（如lmo1、cdx4、mafa）和轴突导向受体。通过蛋白互作预测揭示运动神经元受体与慢肌前体细胞分泌的细胞外信号分子（如胶原XIX、层粘连蛋白）的相互作用网络，为理解运动神经元分化机制和轴突路径选择提供了新的分子框架。

　　

当我们观察斑马鱼胚胎优雅的游动时，很少会想到这背后隐藏着一个精密的神经连接系统。运动神经元（MN）作为连接中枢神经系统与骨骼肌的"桥梁"，其轴突能否准确导航至目标肌肉直接决定了运动功能的正常执行。在斑马鱼每个体节中，三类初级运动神经元（pMN）——头端初级（RoP）、中间初级（MiP）和尾端初级（CaP）——分别支配外侧、背侧和腹侧肌节，形成完美的神经支配模式。然而，这些形态相似的神经元如何获得独特的身份特征，又如何在共同的路径上分道扬镳，一直是神经发育领域的未解之谜。

传统上，研究人员通过解剖位置区分这些运动神经元亚型，但对其分子身份的认识仍十分有限。虽然已知LIM同源框基因（如islet1、islet2）的组合表达模式参与运动神经元特化，以及慢肌前体细胞（SMP）分泌的导向分子引导轴突生长，但驱动运动神经元亚型分化和轴突路径选择的具体分子机制仍不清楚。正是为了填补这一知识空白，由Laurie Nemoz-Billet等研究人员组成的团队在《iScience》上发表了这项开创性研究。

研究人员主要运用了以下关键技术：首先通过流式细胞分选术从24 hpf（小时受精后）Tg(mnx1:gfp)斑马鱼胚胎躯干中分离GFP阳性的运动神经元群体；接着采用10X Genomics单细胞RNA测序技术对4,040个细胞进行转录组分析；利用Monocle3进行伪时间轨迹重建；通过单分子廉价荧光原位杂交（smiFISH）验证关键标记基因的表达模式；结合STRING数据库预测受体-配体相互作用网络。

单细胞RNA测序识别转录不同的簇，重现斑马鱼胚胎中MN分化阶段

研究团队首先建立了从斑马鱼胚胎躯干分离运动神经元并进行单细胞RNA测序的完整流程。通过无偏聚类分析，他们从4,040个细胞中鉴定出14个转录不同的簇，不仅包含运动神经元，还包括表达mnx1的内源性细胞类型，如中间神经元、胰腺细胞和脊索细胞。通过分析olig2（运动神经元前体标记）、sox19a（前体细胞标记）、pcna（增殖细胞标记）和elavl4（有丝分裂后神经元标记）的表达模式，研究人员成功识别出处于不同分化阶段的细胞群体，包括运动神经元前体、有丝分裂后神经元和成熟的运动神经元。

不同的基因表达特征描述pMN亚型和轨迹

通过重点分析mnx1高表达的390个细胞，研究人员进一步识别出7个pMN亚簇。伪时间分析显示这些亚簇代表从早期到终末分化的连续状态，其中簇1为最不分化状态，簇3、6、7为最分化状态。基因本体（GO）分析显示，与"轴突发育"、"神经元投射形态发生"和"神经元分化"相关的术语显著富集。通过结合islet1和islet2a的表达模式以及smiFISH验证，研究团队成功将簇6鉴定为CaP神经元（高表达islet2a），簇3为RoP神经元（高表达islet1），簇7为MiP神经元。轨迹分析揭示了一个关键的分支点：簇4产生两个分支，一支通向MiP亚型，另一支通向RoP亚型，而CaP亚型则遵循独立的分化路径。

不同的TF组合定义pMN亚型

研究人员进一步分析了每个pMN亚型前50个差异表达基因（DEG），发现转录因子家族是各亚型中最具差异性的基因类别，分别占RoP、MiP和CaP的10%、28%和14%。这些差异表达的转录因子包括已知的标记基因如CaP中的islet2a和MiP中的mnx2b，以及新发现的亚型特异性标记：RoP特异性表达lmo1、mafaa、maff、nfe2l1b等；MiP特异性表达cdx4、ddit3、hoxd9a、Jun等；CaP特异性表达isl2a、mafa、pbx3b、tbx3b等。通过smiFISH实验，研究人员验证了lmo1主要在RoP中表达，cdx4在MiP中表达，mafa在CaP/VaP中表达，证实了这些转录因子的亚型特异性。

细胞外信号和MN受体配对塑造选择点的亚型分化

研究团队还分析了pMN亚型特异性膜受体的表达模式，包括ephrin、neuropilin、plexin、Robo、BMP受体、cadherin、integrin、FGF和GDNF受体等已知参与运动轴突导航的受体家族。通过整合先前获得的慢肌前体细胞（SMP）单细胞转录组数据，研究人员预测了pMN受体与SMP分泌的细胞外信号分子之间的潜在相互作用。例如，MiP和CaP均表达itgb1a和itga6b，形成能与基底膜蛋白（Laminin γ1、Laminin α5、CollVα1、CollVα2）相互作用的integrin α6β1受体。MiP特异性表达ephb2b和robo1，其已知结合伙伴分别为ColXIXα1、Ntn5和Ntn1a。这些预测性分析为理解pMN轴突导航的分子机制提供了新的框架。

这项研究通过单细胞转录组学方法，首次系统揭示了斑马鱼初级运动神经元亚型特异的基因表达特征，证实RoP、MiP和CaP确实代表分子水平上不同的细胞亚型。研究不仅验证了已知的LIM同源框基因表达模式，还发现了新的亚型特异性转录因子，如lmo1、cdx4和mafa。轨迹分析表明pMN亚型身份并非预先决定，而是通过多步骤分化过程逐渐获得。研究还意外发现离子通道基因在不同亚型中的差异性表达，提示各亚型可能具有不同的电生理特性。

更重要的是，受体-配体相互作用网络分析揭示了运动神经元与其微环境之间复杂的信号对话，为理解轴突在选择点分叉的分子机制提供了新视角。这些发现不仅深化了对斑马鱼运动神经系统发育的认识，也为研究其他脊椎动物运动神经元的发育和连接提供了重要参考。尽管研究存在对稀有细胞群体（如VaP）代表性不足、预测性互作需要功能验证等局限性，但它为未来研究运动神经元分化、轴突导向和神经肌肉连接建立提供了宝贵的资源平台。