VioC酶立体选择性催化D-精氨酸氧化脱氨机制的量子力学/分子力学研究

《iScience》：Mechanistic insights into the selective oxidation of D-arginine by the nonheme iron-dependent viomycin biosynthesis enzyme VioC

本研究针对非血红素铁依赖酶VioC如何通过底物手性控制反应选择性的关键科学问题，通过QM/MM模拟揭示了D-精氨酸氧化脱氨的原子级机制。研究发现D-精氨酸的C2-H键通过优化几何构象增强σ轨道排列，引导初始氢原子转移，随后铵基的HAT驱动C2-N去饱和形成阳离子亚胺中间体。该工作阐明了Fe/2OG依赖加氧酶中反应分叉的立体控制原理，为理解酶催化立体选择性提供了新范式。

　　

在生物合成领域，非血红素铁依赖的2-氧代戊二酸加氧酶（Fe/2OG）家族因其能够催化多种氨基酸的氧化修饰而备受关注。这类酶通常表现出严格的区域选择性，例如在天然产物生物合成中，OrfP、VioC、NapI和CmnC虽然都作用于L-精氨酸（L-Arg），却能在氨基酸侧链的不同位置进行修饰，从而生成各异的天然产物。然而，一个令人困惑的现象是：VioC酶不仅能催化L-精氨酸的C3-羟基化，还能对其对映体D-精氨酸（D-Arg）进行氧化脱氨反应，生成2-氧代-5-胍基戊酸（2O5GP）。这种由底物手性差异导致的完全不同的反应路径，其分子机制一直未被阐明。

为了解决这一难题，赵聪等人通过结合分子动力学（MD）模拟和量子力学/分子力学（QM/MM）计算，揭示了VioC催化D-精氨酸氧化脱氨的详细机制。研究发现，D-精氨酸的手性使其C2-H键更接近Fe(IV)-oxo中间体，并优化了几何构型以增强σ轨道排列，从而引导初始氢原子从C2位置转移。随后的反应路径中，从铵基团发生的氢原子转移（HAT）优于Glu介导的质子耦合电子转移（PCET）路径，驱动C2-N去饱和形成阳离子亚胺中间体。C2-羟基化和C2-C3去饱和路径因能垒较高而被排除。该阳离子亚胺中间体最终水解生成酮产物。

研究采用的主要技术方法包括：基于晶体结构（PDB: 6MP8）构建酶-底物复合物模型，进行微秒级分子动力学模拟分析底物结合构象；运用QM/MM方法计算反应能垒和过渡态结构；通过密度泛函理论（DFT）计算键解离能和溶液中的水解反应能垒。

MD simulations of substrate binding

通过1微秒的MD模拟发现，D-精氨酸的胍基基团与Leu156、Asp268和Asp270形成稳定的氢键网络，锚定了底物骨架。关键的是，氧原子与底物各氢原子的距离分析显示，α-氢（C2-H）距离最近（2.06±0.19 ?）且分布最集中，而β-氢（C3-H）和γ-氢（C4-H）距离较远且波动较大，表明C2-H是主要的HAT位点。

The Fe(IV)-oxo complex and its reactivity toward HAT

QM/MM优化后的Fe(IV)-oxo复合物中Fe-O键长为1.62 ?，与实验值吻合。自旋密度分析表明FeO单元有四个未配对电子。反应通过σ通道进行，C2-H提取的能垒（12.8-13.8 kcal/mol）显著低于C3-H（>22 kcal/mol）和C4-H提取，且Fe-O-H角更大（148.8-161.4°），O-H-C角更接近线性（>172°），优化了几何构型。

C-N desaturation: A preferred pathway over hydroxylation and C-C desaturation

在初始HAT形成的Fe(III)-OH复合物（IM1c2）中，后续反应路径比较表明：铵基直接HAT路径（a）能垒最低（Boltzmann平均2.3 kcal/mol），形成C=N双键；Glu170介导的PCET路径（b）能垒较高；OH回弹路径（c）产生C2-羟基化产物，能垒为6.0 kcal/mol；C3-H提取路径（d）导致C2=C3去饱和，能垒最高。SNO分析证实路径（a）的过渡态中单占据β自旋轨道主要定域在C2原子上。

Hydrolysis of the imine intermediate

阳离子亚胺中间体（RCHI）在蛋白质环境中的水解能垒为28.2 kcal/mol，而在水溶液中降至15.9 kcal/mol，表明酶活性中心的几何约束限制了水解反应速率。水解过程经历水分子亲核攻击形成两性离子中间体，随后C-N键断裂生成最终产物。

研究结论表明，底物手性通过控制活性位点可及性决定了反应选择性。D-精氨酸的构型使其C2-H键处于最优空间位置，引导初始HAT从传统的C3-H（L-精氨酸加工中观察到）转向C2-H位置。这种手性诱导的HAT位点转变从根本上改变了后续催化轨迹，最终导致观察到的氧化脱氨而非羟基化反应。该研究揭示了几何约束和内在键能在控制反应选择性中的协同作用，为未来生物催化剂设计提供了重要理论基础。