单细胞与批量转录组整合分析鉴定THBS1作为子宫内膜异位症新型生物标志物及其TGF-β通路调控机制研究

《iScience》：THBS1 identificated as an endometriosis biomarker through evidence from single-cell and bulk transcriptomic profiling

本研究针对子宫内膜异位症诊断依赖有创手术的临床困境，通过整合批量与单细胞转录组数据分析，首次系统鉴定THBS1为疾病关键基因。研究人员通过免疫组化验证其在异位内膜高表达，功能实验证实THBS1通过TGF-β通路调控内膜细胞增殖/迁移/侵袭，动物实验证明其沉默可抑制异位病灶生长。该研究为开发无创诊断标志物提供了新靶点，对早期诊断和治疗策略创新具有重要意义。

　　

对于全球约10%的育龄女性而言，子宫内膜异位症是一种带来长期痛苦的慢性疾病，其特征是子宫内膜组织异常生长到子宫腔外。患者常遭受痛经、慢性盆腔疼痛和不孕的困扰，但确诊过程却充满挑战——目前金标准诊断依赖腹腔镜手术，导致诊断延迟可达4-11年，约65%的患者曾被误诊。这种延迟不仅加重患者痛苦，还可能对生育能力造成不可逆影响。

为什么子宫内膜异位症的诊断如此困难？主要是因为症状非特异性且缺乏可靠的生物标志物。腹腔镜手术虽能直观发现病灶，却无法检测微观血管化和神经支配，可能遗漏早期病变。因此，开发无创诊断方法成为该领域迫切需求。

在这项发表于《iScience》的研究中，张丽琪等人将目光投向分子机制，试图寻找参与疾病发生发展的关键基因。研究人员特别关注TGF-β(转化生长因子β)信号通路，该通路在细胞生长、分化、细胞外基质产生和免疫调节中起核心作用。在子宫内膜异位症中，TGF-β通路异常激活可促进异位内膜细胞的存活、粘附、增殖和侵袭能力，是疾病进展的关键驱动因素。

为开展研究，团队采用多组学整合分析策略，结合批量RNA测序和单细胞RNA测序数据，系统比较了异位子宫内膜、在位子宫内膜和正常子宫内膜的基因表达差异。通过生物信息学方法筛选出5个与TGF-β通路相关的候选基因，最终聚焦于血小板反应蛋白1(THBS1)——一个在肿瘤领域被广泛研究但在子宫内膜异位症中了解甚少的基因。

THBS1是一种多功能糖蛋白，含有多个功能结构域，可与不同分子特异性结合，参与细胞与细胞外基质的相互作用。研究发现，THBS1在多种人类疾病和肿瘤中发挥重要作用，但其在子宫内膜异位症中的具体功能尚不明确。

关键技术方法概述

研究整合了GEO数据库中的多个转录组数据集(GSE25628用于批量RNA测序；GSE213216、GSE179640、GSE214411用于单细胞RNA测序)，采用生物信息学方法筛选差异表达基因。实验验证部分包含89例临床样本(60例子宫内膜异位症患者和29例对照)的免疫组化分析，原代细胞培养后进行功能实验(THBS1基因敲低和过表达)，通过CCK-8法、流式细胞术、Transwell实验评估细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。动物实验采用BALB/c裸鼠皮下异位移植模型，通过局部注射siRNA验证THBS1在体内的功能。

识别差异表达基因

通过分析GSE25628数据集(包含8对在位-异位内膜样本和6例正常内膜样本)，研究人员发现异位内膜与正常内膜相比有2,620个基因上调表达，2,503个基因下调表达；而在位内膜与正常内膜相比，有2,104个基因上调和1,801个基因下调。基因集变异分析(GSVA)显示，异位内膜样本中脂酸代谢和RNA降解等通路显著上调，表明其代谢活性和蛋白质合成机制增强。

单细胞转录组分析鉴定了9种细胞类型，其中基质细胞最为丰富。细胞通讯分析表明，在子宫内膜异位症中，基质细胞通过调节微环境和促进细胞间通讯，在疾病发病机制中起重要作用。

识别子宫内膜异位症发展的关键基因

通过整合批量与单细胞数据，研究人员绘制维恩图筛选出5个与TGF-β通路相关的关键基因：NBL1、EMP3、ID2、DCN和THBS1。文献回顾显示，THBS1在子宫内膜异位症中研究较少且直接调控TGF-β，因此被选为后续研究重点。热图分析证实THBS1主要在基质细胞中高表达。

THBS1在子宫内膜异位症患者异位子宫内膜组织中表达升高

免疫组化分析显示，TGF-β和THBS1在子宫内膜异位症患者的异位内膜中表达显著高于在位内膜和正常内膜。Western blot分析进一步证实，THBS1敲低后TGF-β1表达明显降低，表明THBS1抑制可减弱TGF-β信号通路激活。

THBS1调控体外增殖、迁移和侵袭

在异位内膜细胞中敲低THBS1可抑制细胞增殖，导致G1期细胞周期阻滞；而在在位内膜细胞中过表达THBS1则增强细胞活力，减少G1期细胞比例，增加S期细胞比例。凋亡实验显示，THBS1敲低增加细胞凋亡(尤其是早期凋亡)，而过表达则降低凋亡率。Transwell实验表明，THBS1敲低显著减少细胞迁移和侵袭数量，而过表达则促进这些能力。

THBS1敲低显著抑制体内异位子宫内膜异位症发展

研究人员建立了两种小鼠模型：腹腔异种移植模型和皮下异种移植模型。皮下模型成功率更高(80%)，因此被选为主要实验平台。将人子宫内膜片段异位移植到裸鼠腋窝区域后，局部注射THBS1 siRNA可显著抑制异位病灶生长，病灶体积明显小于对照组。免疫组化证实si-THBS1组THBS1表达显著降低。

研究结论与意义

本研究通过整合多组学数据首次系统鉴定THBS1为子宫内膜异位症的关键调控因子，证实其在异位内膜中高表达并通过TGF-β通路促进疾病进展。THBS1可调控子宫内膜细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力，在动物模型中其沉默能有效抑制异位病灶生长。

这些发现不仅深化了对子宫内膜异位症发病机制的理解，更重要的是为开发非侵入性诊断方法提供了潜在靶点。THBS1作为候选生物标志物，有望帮助解决当前子宫内膜异位症诊断延迟的临床难题，为早期干预和治疗策略创新奠定基础。

研究也存在一定局限性，如基于单一批量RNA测序数据集可能影响结果普适性，免疫缺陷小鼠模型不适合免疫学研究等。未来需要更多研究验证THBS1的具体作用机制，并探索其在临床诊断和治疗中的应用潜力。