ANKLE1作为DNA张力传感器通过切割机械应力下的DNA解析染色质桥的新机制

《Nature Communications》：ANKLE1 processes chromatin bridges by cleaving mechanically stressed DNA

本期推荐一项关于细胞分裂过程中基因组稳定性维持机制的重要研究。针对染色质桥(chromatin bridge)过度拉伸破裂导致基因组不稳定的难题，研究团队发现中体(midbody)锚定核酸酶ANKLE1能够感知DNA张力与超螺旋，特异性切割处于机械应力下的DNA。单分子分析显示，在较高拉伸力下ANKLE1可切割负超螺旋DNA的双链，揭示其通过解析拉伸的染色质桥维护基因组完整性的新机制，为理解细胞分裂质量控制提供了新视角。

　　

在细胞分裂的最后阶段，经常可以看到一种被称为"染色质桥"的微观结构连接着两个即将分离的子细胞。这些由未完全分离的染色体形成的桥梁，正经历着纺锤丝牵引和细胞迁移产生的巨大张力。如果这些桥梁在肌动蛋白-肌球蛋白收缩力的作用下随机断裂，将会导致灾难性后果——微核形成、复杂基因组重排（如断裂-融合-桥循环、染色体碎裂和癌基因扩增）以及cGAS-STING通路的异常激活。

长期以来，科学界一直在探索细胞是否进化出了专门的机制来处理这些染色质桥，防止其灾难性破裂。尽管先前的研究发现线虫的LEM-3及其人类同源蛋白ANKLE1是中体锚定的核酸酶，与染色质桥处理有关，但ANKLE1在人类细胞中的具体作用机制仍不明确。特别是，ANKLE1敲除并不影响姐妹染色单体交换水平，这对其直接切割连接分子的假说提出了挑战。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，香港大学、深圳湾实验室和弗朗西斯·克里克研究所的研究团队合作揭示了ANKLE1的一个独特特性：它能够感知并响应细胞分裂过程中DNA的张力和超螺旋状态。研究人员发现，ANKLE1并非通过切割重组中间体发挥作用，而是直接作用于染色质桥，其DNA切割活性受到DNA张力和超螺旋的显著增强。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对内源性ANKLE1进行GFP标记，利用免疫共沉淀和免疫荧光分析蛋白定位与相互作用；采用磁镊单分子技术分析DNA在机械应力下的切割动力学；通过体外核酸酶活性实验检测ANKLE1对不同DNA底物的特异性；使用细胞生物学方法评估基因敲除对染色质桥长度和细胞存活的影响。实验主要使用了HeLa、HCT116和eHAP等细胞系。

ANKLE1通过RACGAP1招募至中体以防止桥过度拉伸

研究人员首先通过CRISPR/Cas9技术在eHAP细胞中对内源性ANKLE1进行GFP标记，证实了ANKLE1确实定位于中体，与RACGAP1共定位。免疫共沉淀实验显示，ANKLE1在分裂后期与MKLP1和RACGAP1存在相互作用。进一步研究发现，ANKLE1的N端锚蛋白重复结构域（1-128氨基酸）对其在中体的招募至关重要，而LEM结构域则不是必需的。机制上，ANKLE1通过其N端结构与RACGAP1的61-292氨基酸区域（包含ECT2相互作用碱性区域和半胱氨酸丰富的锌结合结构域）相互作用而被招募至中体。

在功能上，通过测量HCT116野生型和ANKLE1^-/-细胞中延伸染色质桥的长度，研究人员发现ANKLE1缺失导致染色质桥显著变长，表明ANKLE1通过处理染色质桥防止其过度拉伸。

ANKLE1与GEN1/MUS81在染色体分离中的非重叠作用

为了阐明ANKLE1在染色体分离中的遗传学关系，研究人员比较了ANKLE1与已知分辨率通路（GEN1和MUS81-EME1/SLX1-SLX4）的功能。结果显示，虽然GEN1和MUS81的缺失导致染色质桥和超细后期桥数量增加，但ANKLE1与GEN1或MUS81的双重缺失并未进一步增加DNA桥的数量。更重要的是，ANKLE1过表达无法补偿GEN1缺失引起的细胞死亡和53BP1焦点增加，而GEN1过表达也无法挽救ANKLE1缺失的表型。这些结果表明ANKLE1不直接参与重组中间体的解析，与GEN1和MUS81在染色体分离中具有非重叠功能。

ANKLE1核酸酶的DNA切割特异性

为了探究ANKLE1的底物特异性，研究人员测试了其对不同DNA结构的切割能力。与GEN1不同，ANKLE1不能切割长的双霍利迪连接体或ΦX174单链环状DNA，但能够特异性切割负超螺旋质粒DNA，主要产生带切口的环状产物和少量线性产物。这种切割活性严格依赖于DNA的超螺旋结构，因为ANKLE1不能切割线性化质粒或带切口的环状质粒。

进一步实验排除了ANKLE1靶向质粒中十字形结构的可能性，因为即使在使用能够形成十字形结构的质粒pIRbke8^mut时，ANKLE1仍表现出与普通质粒相似的切割模式，而GEN1则能特异性切割十字形结构。这些结果证实ANKLE1是一种对超螺旋DNA具有特异性的核酸酶。

ANKLE1特异性结合超螺旋DNA

通过电泳迁移率变动分析，研究人员发现ANKLE1的C端片段（ANKLE1^331-615和ANKLE1^399-615）能够特异性结合超螺旋质粒，而不能结合线性化DNA。值得注意的是，缺失LEM结构域的ANKLE1^399-615仍保留DNA结合和切割活性，表明LEM结构域对这些功能不是必需的。催化失活突变体ANKLE1^331-615(Y453A)仍能结合超螺旋DNA但失去切割活性，进一步证实观察到的条带迁移是由于结合而非切割所致。

ANKLE1在张力下特异性切割负超螺旋DNA的双链

ANKLE1对超螺旋DNA的特异性促使研究人员假设其可能靶向机械应力下的DNA。通过磁镊技术对DNA施加拉伸力和超螺旋，研究发现ANKLE1的核酸酶活性受到张力和超螺旋的显著调节。在较低力（0.5 pN）下，ANKLE1仅切割负超螺旋DNA的一条链；而在较高力（5 pN）下，ANKLE1能够切割双链，且第二条链的切割速率更快。

对于正超螺旋和非超螺旋DNA，即使在较高张力下，ANKLE1也仅切割单链。这表明张力和超螺旋共同加速ANKLE1对第一条DNA链的切割，而负超螺旋是切割第二条链的必要条件。相比之下，GEN1在相同条件下不能切割拉伸的DNA，说明张力增强的切割活性是ANKLE1特有的特性。

不同张力和超螺旋密度下ANKLE1活性分析

通过系统分析不同张力（0.5、1.5、5和10 pN）对ANKLE1活性的影响，研究人员发现DNA平均切割时间在5 pN时显著缩短，继续增加张力不再进一步减少切割时间，表明5 pN的张力已足以完全激活ANKLE1。同时，在恒定5 pN张力下，增加负超螺旋密度（σ = -0.025至-0.1）可持续增强ANKLE1活性，在σ = -0.075和-0.1时超过90%的磁珠从表面脱离。

这些发现表明机械张力和超螺旋密度是调节ANKLE1核酸酶活性的关键因素，几个皮牛顿的张力足以完全激活切割，而更高的负超螺旋则增强酶的效率。

研究结论与意义

本研究揭示了ANKLE1在维持基因组完整性中的一个前所未有的功能：作为DNA张力传感器。ANKLE1的活性受到机械应力的增强，这一特性使其与其他已知的机械敏感蛋白区别开来。特别重要的是，研究中使用的DNA超螺旋密度（σ = -0.1）与染色质桥拉伸时核小体解离所释放的生理相关超螺旋密度（约-0.09至-0.06）非常接近，表明这一机制具有显著的生理相关性。

与线虫LEM-3不同，人ANKLE1不切割复制/重组中间体，强调了其独特的底物偏好。研究人员提出，在人类细胞中，SMX和GEN1作为主要的核酸酶解析通路，作用于逃逸BTR介导的霍利迪连接体解离的中间体，而ANKLE1则利用其独特的张力识别特性来切割任何持续到后期的中间体。

这项研究不仅揭示了ANKLE1通过感知DNA张力来解析拉伸染色质桥的新机制，还突出了机械力在DNA桥处理中的重要性，增强了我们对细胞在分裂过程中如何保持基因组完整性的理解。这些发现为开发针对基因组不稳定性相关疾病（如癌症）的新治疗策略提供了重要理论基础。