发现β-抑制蛋白偏向性CCKBR激动剂MF-8：揭示长时程增强的信号通路机制并阻断恐惧记忆形成

《Nature Communications》：Discovery of a β-arrestin-biased CCKBR agonist that blocks CCKBR-dependent long-term potentiation

本研究针对CCKBR依赖性长时程增强（LTP）机制不明的难题，开发了β-抑制蛋白偏向性CCKBR激动剂MF-8。研究发现CCKBR-LTP依赖于Gαq/11-Ca2+和Gαs-cAMP信号通路，而MF-8通过特异性偏向β-抑制蛋白信号通路，有效阻断LTP形成和线索-线索关联恐惧记忆，为CCKBR靶向药物开发提供了新策略。

　　

在大脑复杂的信息处理网络中，G蛋白偶联受体（GPCR）如同精密的信号转换器，调控着从情绪到记忆的多种高级神经功能。其中，胆囊收缩素B受体（CCKBR）作为神经肽胆囊收缩素的重要受体，被发现能够诱导大脑新皮层的兴奋性突触传递长时程增强（LTP），从而增强记忆形成。有趣的是，CCKBR的拮抗剂不仅能够减弱杏仁核中的这种增强效应，还能缓解抑郁样行为。然而，驱动CCKBR依赖性LTP的具体分子机制一直是个未解之谜，更缺乏能够特异性调控这一过程信号通路偏向性的CCKBR配体。

传统观点认为GPCR主要通过G蛋白传递信号，但随着研究深入，科学家发现β-抑制蛋白同样在GPCR信号转导中扮演关键角色。更复杂的是，同一GPCR可能激活不同的G蛋白亚型和β-抑制蛋白，产生截然不同的生物学效应。这种信号通路的“偏向性”为药物研发提供了新思路：如果能设计出特异性激活某些信号通路而避免其他通路的药物，就有望在治疗疾病的同时减少副作用。一个成功案例是2020年FDA批准的μ-阿片受体G蛋白偏向性激动剂oliceridine，它在保持镇痛效果的同时显著降低了β-抑制蛋白介导的耐受、成瘾和呼吸抑制等副作用。

面对CCKBR信号机制的挑战，由香港城市大学何菊芳教授领导的研究团队展开系统性探索。他们首先从CCK4（胆囊收缩素8s的羧基末端四肽片段）出发，通过结构修饰获得一系列化合物，并利用钙动员实验和PRESTO-Tango实验筛选其信号通路特性。令人惊喜的是，他们发现化合物MF-8在激活β-抑制蛋白2信号方面表现出色（EC₅₀=4.54 nM），而对Gα_q/11-Ca²⁺信号激活能力较弱（EC₅₀=516.00 nM），偏向因子β>2，表明MF-8是强效的β-抑制蛋白偏向性CCKBR激动剂。

为验证结合特性，团队创新性地设计了基于荧光共振能量转移（FRET）的结合实验系统。该系统由两部分组成：荧光探针和修饰的CCKBR。他们在CCK5的氨基末端连接罗丹明，在CCKBR的氨基末端连接HaloTag蛋白。实验结果显示，MF-8与CCKBR的结合亲和力（IC₅₀=0.9 nM）与内源性配体CCK8s（IC₅₀=1.1 nM）相当，进一步证实了MF-8的高效激动剂特性。

研究的关键突破在于揭示了CCKBR-LTP的信号机制。通过多电极阵列（MEA）记录小鼠听觉皮层（AC）脑片的场兴奋性突触后电位（fEPSPs），研究人员发现CCK8s联合低频电刺激（LFS）能够诱导LTP，而MF-8即使在200 nM浓度下也无法诱导LTP。这一现象提示CCKBR-LTP可能不依赖于β-抑制蛋白信号通路。

为验证这一假设，研究人员使用β-抑制蛋白信号阻断剂barbadin处理脑片，或通过腺相关病毒（AAV）介导的shRNA敲低β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2表达，发现CCKBR-LTP仍能正常诱导。这些药理学干预和基因表达调控实验一致表明，CCKBR-LTP的形成不依赖于β-抑制蛋白信号。

那么，CCKBR-LTP究竟依赖于哪些信号通路？通过一系列信号通路阻断剂实验，研究人员发现Gα_q/11信号通路阻断剂（U-73122、2-APB、YM254890）和Gα_s信号通路阻断剂（H-89）能显著抑制LTP形成，而Gα_i信号通路阻断剂PTX和β-抑制蛋白信号阻断剂barbadin则无影响。这些结果明确显示，听觉皮层中的CCKBR-LTP主要依赖于Gα_q/11和Gα_s信号通路，尤其是Gα_q/11信号通路。

进一步研究发现，MF-8对CCKBR具有高度选择性。在CCKAR和GPR173（另外两种CCK受体）的实验中，即使10μM浓度的MF-8也几乎不激活这些受体的下游信号通路，表明MF-8是CCKBR特异性激动剂。

β-抑制蛋白信号通路的一个典型功能是介导GPCR激活后的内化过程。研究人员通过三种不同的检测系统观察发现，MF-8能有效诱导CCKBR内化，其效果与CCK8s相当。这从功能层面证实了MF-8确实能够激活β-抑制蛋白信号通路。

更有意义的是，MF-8能够高效阻断CCKBR介导的钙信号、cAMP积累和LTP。钙动员实验显示，MF-8抑制CCK8s诱导的钙流增加，IC₅₀=22.7 nM；cAMP实验表明，MF-8抑制CCK8s诱导的cAMP积累，IC₅₀=16 nM。更重要的是，MF-8能完全阻断θ节律爆发刺激（TBS）诱导的CCKBR-LTP。

为确认MF-8通过β-抑制蛋白信号通路抑制LTP，研究人员通过分子对接和分子动力学模拟分析了MF-8与CCKBR的相互作用模式，发现N353^6.55是决定MF-8β-抑制蛋白偏向性的关键位点。当该位点突变为丙氨酸（N353A）后，MF-8对TBS诱导的CCKBR-LTP的阻断作用消失。同时，使用barbadin阻断β-抑制蛋白信号或敲低β-抑制蛋白表达，也能减轻MF-8对LTP的抑制作用。这些结果强有力地证明，MF-8确实通过β-抑制蛋白信号通路抑制CCKBR-LTP。

研究的最终价值体现在行为层面。通过线索-线索恐惧记忆实验，研究人员发现MF-8处理能有效抑制CCKBR依赖性恐惧记忆的形成。在训练前给C57小鼠腹腔注射MF-8（100μg/kg），结果显示MF-8组小鼠的冻结百分比显著低于盐水对照组，证明MF-8在活体水平也能阻断CCKBR介导的记忆过程。

本研究主要采用了以下关键技术方法：基于FRET的结合实验评估配体-受体亲和力；钙动员实验、PRESTO-Tango实验、BRET-based β-抑制蛋白实验和TRUPATH分析全面评估化合物信号通路特性；多电极阵列记录脑片突触可塑性；分子对接和动力学模拟解析配体-受体相互作用；免疫荧光和共聚焦显微镜观察受体内化；AAV介导的基因操作（包括过表达和shRNA敲低）以及化学遗传学工具验证特定信号通路功能；小鼠线索-线索恐惧记忆行为范式评估认知功能。

MF-8与CCKBR具有高亲和力结合

通过系统筛选CCK4修饰化合物，发现MF-8对CCKBR具有高亲和力（IC₅₀=0.9 nM），并且在PRESTO-Tango实验中表现出强效的β-抑制蛋白2信号激活能力（EC₅₀=4.54 nM），偏向因子β>2，确认为β-抑制蛋白偏向性激动剂。

听觉皮层中CCKBR-LTP不依赖于β-抑制蛋白信号

MF-8无法诱导LTP，而β-抑制蛋白信号阻断剂barbadin处理和β-抑制蛋白敲低不影响CCKBR-LTP形成，表明该LTP不依赖于β-抑制蛋白信号通路。

听觉皮层中CCKBR-LTP依赖于Gα_q/11和Gα_s信号

药理学实验显示，Gα_q/11和Gα_s信号通路阻断剂能抑制LTP，而Gα_i和β-抑制蛋白信号阻断剂无影响，表明CCKBR-LTP主要依赖于Gα_q/11和Gα_s信号通路。

MF-8是β-抑制蛋白偏向性和CCKBR选择性激动剂

TRUPATH分析表明，与CCK8s相比，MF-8对β-抑制蛋白信号具有更强偏向性，且对CCKAR和GPR173几乎无活性，显示高度CCKBR选择性。

MF-8能够诱导CCKBR内化

三种不同的β-抑制蛋白-CCKBR共定位实验证实，MF-8能有效诱导受体内化，效果与CCK8s相当，证明其功能性激活β-抑制蛋白信号通路。

CCKBR介导的钙信号、cAMP积累和LTP可被MF-8高效阻断

MF-8能浓度依赖性地抑制CCK8s诱导的钙流增加（IC₅₀=22.7 nM）和cAMP积累（IC₅₀=16 nM），并完全阻断TBS诱导的CCKBR-LTP。

MF-8以β-抑制蛋白依赖性方式阻断CCKBR-LTP

分子模拟发现N353^6.55是关键位点，该位点突变或β-抑制蛋白信号阻断/敲低均能消除MF-8对LTP的抑制作用，证明MF-8通过β-抑制蛋白信号通路发挥阻断效应。

MF-8处理抑制CCKBR-LTP介导的线索-线索恐惧记忆

行为实验表明，MF-8能显著抑制CCKBR依赖性恐惧记忆形成，验证了其在体水平的生理功能。

这项发表于《Nature Communications》的研究具有多重重要意义。首先，它首次揭示了CCKBR-LTP的具体信号机制，明确其依赖于Gα_q/11和Gα_s信号通路，而不依赖于β-抑制蛋白信号。这一发现不仅深化了对CCKBR神经调控功能的理解，也为针对特定信号通路的精准干预提供了理论依据。

其次，研究团队成功开发的β-抑制蛋白偏向性CCKBR激动剂MF-8，作为工具化合物能够特异性激活β-抑制蛋白信号而减弱G蛋白信号，为研究CCKBR不同信号通路的生理功能提供了有力工具。MF-8通过促进CCKBR内化，可能加速受体脱敏，从而间接抑制G蛋白信号通路，这种独特的作用机制为GPCR偏向性药物设计提供了新思路。

更重要的是，MF-8在行为层面展示的恐惧记忆抑制效果，暗示了β-抑制蛋白偏向性CCKBR激动剂在治疗恐惧相关精神疾病（如创伤后应激障碍、焦虑症、抑郁症）方面的潜在应用价值。通过特异性调控CCKBR信号通路，可能实现治疗效果的最大化和副作用的最小化。

从更广泛的视角看，这项工作展示了偏向性配体在神经科学研究和药物开发中的强大潜力。如同β₂肾上腺素能受体的β-抑制蛋白偏向性激动剂卡维地洛能够增强骨骼肌力量而避免心律失常一样，CCKBR的偏向性配体也有望在调控记忆和情绪的同时减少潜在副作用。尽管MF-8在神经系统疾病治疗中的具体应用前景仍需进一步探索，但这一发现无疑为我们理解CCKBR的神经系统功能提供了新视角，也为开发针对CCKBR及其他GPCR的靶向药物开辟了新途径。

未来，通过冷冻电镜解析MF-8与CCKBR复合物的精细结构，将有望揭示β-抑制蛋白信号通路激活的精确分子机制，为设计更具特异性的偏向性药物提供结构基础。随着对GPCR信号偏向性机制的深入理解，精准靶向特定信号通路的药物设计策略必将在神经精神疾病治疗领域发挥越来越重要的作用。