基于细胞突起来源细胞外囊泡的高效蛋白递送系统及其在细胞迁移和基因组编辑中的应用

《Nature Communications》：Efficient cellular transformation via protein delivery through the protrusion-derived extracellular vesicles

本研究报道了细胞膜突起来源的细胞外囊泡（EVs）能够高效递送功能性蛋白。研究人员发现血清中的大型EVs（I-EVs）含有Rac1蛋白，通过CIP4依赖的内吞作用进入细胞，经内体运输后释放到胞质，显著增强细胞迁移。通过工程化改造，将基因组编辑蛋白Cas12f包装到MIM依赖的突起衍生EVs中，其递送效率显著高于内体来源的EVs。该研究为EVs作为新型生物分子递送平台提供了新策略。

　　

在生命科学领域，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的重要媒介备受关注。这些由细胞分泌的脂质膜结构能够携带蛋白质、RNA等生物活性分子，在受体细胞中发挥功能。然而，EVs根据其生物发生途径主要分为两类：内体来源的EVs（外泌体）和细胞膜突起来源的EVs（ectosomes）。尽管内体来源的EVs已被广泛研究并工程化用于治疗性蛋白递送，但其递送效率仍不理想。相比之下，细胞膜突起来源的EVs在蛋白递送方面的潜力却鲜为人知。

血清中含有丰富的EVs，即使在没有生长因子信号的情况下也能诱导细胞迁移，这表明血清中可能存在未知的刺激因子。研究表明，Rho家族小GTP酶Rac1在调节细胞迁移中起关键作用，且已在血清来源的EVs中检测到Rac1的存在。然而，EVs中的Rac1是否具有功能活性以及其作用机制尚不清楚。

日本奈良先端科学技术大学院大学的Shiro Suetsugu教授团队在《Nature Communications》上发表的研究，系统阐述了细胞膜突起来源的EVs在功能性蛋白递送中的优势。研究发现，依赖于I-BAR结构域蛋白MIM（Missing-in-metastasis）产生的突起衍生EVs，能够以类似于显微注射的效率递送功能性小GTP酶Rac1蛋白。更重要的是，通过工程化改造，这些EVs还能高效递送基因组编辑蛋白Cas12f，为EVs作为治疗性蛋白递送平台开辟了新途径。

研究人员采用的主要技术方法包括：差速离心分离EVs、蛋白质印迹分析、伤口愈合实验、超分辨率显微镜（3D-SMLM）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、以及基于CRISPR-Cas12f的基因组编辑报告系统。血清样本来源于胎牛血清（FBS），细胞模型主要使用HEK293和PANC-1细胞系。

血清EVs通过CIP4依赖性内吞作用促进细胞迁移

研究发现，血清中的大型EVs（I-EVs） fraction含有Rac1蛋白，而小型EVs（s-EVs） fraction中则未检测到Rac1。在伤口愈合实验中，野生型（WT）PANC-1细胞在含有EVs的血清中表现出显著的迁移能力，而CIP4基因敲除（KO）细胞的迁移能力减弱。当使用超速离心去除血清中的EVs后，WT细胞的迁移能力降至与CIP4 KO细胞相当的水平。添加从血清中分离的I-EVs fraction能显著增强WT细胞的迁移，但对CIP4 KO细胞无此效果。动力蛋白抑制剂dynasore处理能抑制WT细胞由I-EVs诱导的迁移，表明该过程依赖于内吞作用。

MIM依赖性EVs的内吞作用诱导细胞迁移

研究人员发现，从表达MIM I-BAR结构域的HEK293细胞中分离的I-EVs fraction能促进WT PANC-1细胞的迁移，而对CIP4 KO细胞无影响。dynasore处理能抑制这种迁移促进效应，表明MIM依赖性I-EVs通过内吞依赖性机制促进细胞迁移，与血清来源的I-EVs fraction类似。

突起衍生EVs中Rac1在细胞迁移中的功能

Western blotting分析显示，Rac1存在于从表达GFP或GFP-MIM的HEK293细胞分离的I-EVs fraction中，也存在于FBS的I-EVs fraction中，但在s-EVs fraction中缺失。用Rac抑制剂EHT1864处理I-EVs fraction后，其促进细胞迁移的能力丧失。在HEK293细胞中共同表达MIM I-BAR和组成型活性Rac1 G12V或显性负性Rac1 T17N突变体，并将这些突变体封装到I-EVs中。WT细胞暴露于含有Rac1 T17N的I-EVs fraction时，迁移速度较慢。此外，单独添加纯化的Rac1蛋白并不能增强WT细胞相对于CIP4 KO细胞的迁移，表明EVs包裹的Rac1在促进细胞迁移中起重要作用。

MIM依赖性EVs在CIP4定位位点的摄取

通过三维单分子定位显微镜（3D-SMLM）观察发现，CIP4在纳米尺度上与EVs紧密相邻。CIP4-mEos4b分子在EV颗粒周围呈现不对称定位，这与网格蛋白依赖性内吞的特征相似。

EV源性Rac1的内体运输和胞质释放

免疫染色显示，用Halo-Rac1和mCherry-MIM I-BAR标记的I-EVs在WT受体细胞内，与早期内体标志物EEA1和晚期内体标志物Lamp1共定位。这种共定位随时间推移而增加，但在CIP4 KO细胞中减弱。超分辨率显微镜观察发现，部分EV来源的Halo-Rac1信号与Lamp1阳性晚期内体共定位，并出现明显的"交叉"信号，表明Rac1从内体中释放到细胞质中。用bafilomycin（H⁺-ATPase抑制剂）处理细胞，增加了滞留在内体中的Halo-Rac1信号数量，减少了Rac1的"交叉"事件，并降低了EV源性Halo-Rac1在迁移细胞前缘的定位。

蛋白递送的突起衍生EVs工程化

研究人员利用雷帕霉素诱导的FKBP和FRB结合系统，将基因组编辑酶Cas12f包装到MIM依赖性EVs中。雷帕霉素处理能将Cas12f招募到细胞突起中，并增加其在I-EVs fraction中的含量。建立含有移码GFP编码序列的报告细胞，当Cas12f在靶序列处切割并通过核苷酸插入或缺失修复后，GFP翻译得以恢复。用含有Cas12f的I-EVs处理报告细胞后，GFP阳性细胞数量增加。相比之下，表达MIM 5KA突变体（削弱突起形成）的细胞产生的I-EVs fraction未能诱导报告细胞中GFP表达。CIP4 KO PANC-1报告细胞在含有Cas12f的EVs处理后，GFP阳性率降低，表明MIM依赖性EVs携带Cas12f的摄取是CIP4依赖性的。

突起衍生EVs中货物蛋白的稳定性

Cas12f-containing EV fractions在4°C或37°C下保持30分钟，仍能诱导受体细胞中GFP表达。令人惊讶的是，在56°C下暴露30分钟的EV fractions也保持其诱导GFP表达的能力。在-80°C下储存或在液氮中快速冷冻后在-80°C下储存的EV fractions仍然具有功能。透射电子显微镜（TEM）观察显示，在加热或冷冻处理后，I-EV和s-EV fractions中均存在膜颗粒。

突起衍生与内体衍生EVs的比较

将FKBP与MIM I-BAR结构域或CD63（内体和内体衍生EVs的标志物）融合，以促进FRB标记的Cas12f的包装。通过蛋白质印迹分析每个EV的Cas12f装载效率。在雷帕霉素处理下，来自表达MIM I-BAR的细胞的I-EVs中，每个EV的Cas12f分子平均数为4.3±1.8个；而当Cas12f与T2A序列和MIM I-BAR结构域共同表达时，每个I-EV的Cas12f数量增加到11.2±6.9个。相比之下，CD63介导的包装在雷帕霉素诱导的二聚化下，每个I-EV的Cas12f装载量更高，为55.3±1.3个。然而，在来自表达MIM I-BAR和CD63的细胞的s-EVs fractions中，每个EV的Cas12f含量低于雷帕霉素处理下的I-EVs。将等量的这些I-EVs和s-EVs应用于报告细胞，评估Cas12f的基因组编辑效率。来自表达MIM I-BAR的细胞的I-EVs fraction中的EVs，与来自表达CD63的细胞的EVs以及来自两种细胞的s-EVs fractions中的EVs相比，表现出更高或相似的基因组编辑活性。每个Cas12f蛋白的基因组编辑效率显示，通过MIM I-BAR包装的Cas12f保留的基因组编辑效率是通过CD63包装的约30倍。

本研究揭示了突起衍生EVs在转移功能性蛋白（如Rac1）中的关键作用。定量分析表明，突起衍生EVs是生物活性蛋白（包括基因组编辑酶）的高效多功能递送载体。与内体衍生EVs相比，MIM依赖性突起衍生EVs在递送功能性蛋白方面表现出显著优势，其效率更高，且不需要病毒融合蛋白的修饰。这些EVs对加热和冷冻的稳定性进一步增强了其作为治疗性蛋白递送平台的潜力。血清中含有Rac1的EVs可能在伤口愈合、血管重塑和肿瘤转移等生理过程中发挥重要作用。此外，基于MIM的EVs工程化策略为基因组编辑和其他治疗性蛋白的递送提供了新思路，有望推动EV-based治疗策略的发展。