miRISC靶向mRNA沉默的统一模型：5'种子区与3'非种子区相互排斥的结合模式揭示新机制

《Nature Communications》：A unifying model for microRNA-guided silencing of messenger RNAs

本研究针对microRNA（miRNA）通过RNA诱导沉默复合体（miRISC）靶向信使RNA（mRNA）的机制尚存争议的问题，利用单分子动力学平衡泊松采样（SiMKEPS）技术，揭示了miRISC存在5'种子区（5'S）与3'非种子区（3'NS）相互排斥的两种稳定构象状态，提出了一个统一模型，深化了对RNA沉默疗法机制的理解，对相关疾病治疗具有重要启示。

　　

在生命科学的精密调控网络中，微小的microRNA（miRNA）扮演着举足轻重的角色。这些长约22个核苷酸的非编码RNA，通过与Argonaute 2（Ago2）蛋白等结合形成miRNA诱导的沉默复合体（miRISC），进而靶向结合特定的信使RNA（mRNA），抑制其翻译或促进其降解，从而精细调控基因表达。这一过程对维持细胞正常的生理功能、发育以及内环境稳定至关重要，而其失调则与癌症、神经退行性疾病等多种人类疾病密切相关。然而，尽管科学家们对miRISC的作用有了基本的认识——即其通常通过miRNA 5'端的“种子区”（seed region, 核苷酸g2-g8）与靶mRNA的3'非翻译区（3' UTR）中的互补序列结合来启动沉默过程——但关于其靶向识别的详细机制，尤其是3'非种子区（3' non-seed region, 3'NS）的作用，仍存在许多未解之谜和看似矛盾的现象。

传统的观点认为，miRISC靶向是一个两步过程：首先由5'种子区（5'S）与靶标结合，引发Ago2蛋白的构象变化（特别是α-螺旋7和PAZ结构域作为刚性体的移动），从而为3'非种子区（3'NS）的进一步配对创造条件，稳定结合并可能触发靶标导向的miRNA降解（TDMD）。然而，近年来全基因组范围内的交联、连接和杂交测序（CLASH）等技术发现，存在大量不依赖于经典5'S配对、仅通过3'NS与mRNA编码区（CDS）发生的非经典相互作用，并且部分已被功能验证。这些发现对传统模型提出了挑战：miRNA是否可以不依赖于5'S而直接通过3'NS来识别靶标？5'S和3'NS的靶向识别是协同的、独立的，还是相互排斥的？细胞内天然的miRISC是否存在不同的构象状态来介导这些不同的结合模式？回答这些问题的关键在于能够精确解析单个miRISC分子与靶标相互作用的动力学过程，并揭示其潜在的构象异质性，而这正是以往群体平均测量方法难以实现的。

为了攻克这一难题，来自美国密歇根大学（University of Michigan）的单分子分析课题组（Single Molecule Analysis Group）的Tanmay Chatterjee、Shankar Mandal、Sujay Ray、Alexander Johnson-Buck和Nils G. Walter教授合作，在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种名为“通过平衡泊松采样的单分子动力学”（SiMKEPS）的强大新技术，能够以前所未有的精度直接测量从人类细胞提取物中分离出的天然miRISC与各种模拟靶标mRNA序列的结合和解离速率常数。通过对成千上万个单个结合事件的统计分析，他们揭示了miRISC靶向沉默的一个全新统一模型。

研究者们为开展这项研究，主要运用了几个关键的技术方法：首先是单分子动力学平衡泊松采样（SiMKEPS），该技术结合了单分子pull-down（SiMPull）和表面全内反射荧光（TIRF）显微镜，能够从HeLa细胞全细胞裂解液中免疫沉淀内源性miRISC，并利用荧光标记的短RNA探针作为mRNA靶标模拟物，在单分子水平上实时观测其与miRISC的重复结合/解离动力学，从而获得高精度的速率常数。其次是单分子FRET（smFRET）技术，用于验证种子区和非种子区探针能否同时结合到同一个miRISC复合体上，并研究其构象变化。此外，还采用了爆发（burst）分析等生物信息学方法来分析结合事件的异质性。这些技术的结合使得在近乎天然的细胞环境下深入剖析miRISC的动力学和构象多样性成为可能。

SiMKEPS特异性检测细胞miRISC中的miRNA

研究人员首先建立并验证了SiMKEPS实验体系。他们使用特异性的抗Ago2抗体从HeLa细胞全细胞提取物中免疫沉淀出内源性miRISC复合物，并将其固定在钝化的石英玻片表面。然后，他们将荧光标记的、长度可变且与目标miRNA特定区域（如5'种子区或3'非种子区）完全互补的短RNA探针作为mRNA靶标模拟物，通过TIRF显微镜观察这些探针与单个表面固定的miRISC分子的瞬时、重复结合事件。通过隐马尔可夫模型（HMM）对数百至数千个单个分子的荧光轨迹进行分析，提取结合和解离 dwell time（停留时间），从而计算出精确的动力学参数。研究聚焦于hsa-miR-21-5p（miR-21），因其在HeLa细胞中含量高且无高度同源的家族成员，避免了交叉反应。结果表明，SiMKEPS能够高特异性、高精度地检测miRISC与靶标的相互作用，并能有效区分特异性结合与非特异性背景信号。

miRISC介导的靶标结合保守性的机制基础

利用SiMKEPS，团队系统研究了具有不同长度和互补程度的靶标模拟物（从7 nt到18 nt，主要互补于5'种子区）与miR-21 RISC的相互作用动力学。他们发现，Ago2显著预组织了miRNA的5'S区域，使其与靶标的结合速率常数（k_a）比游离的miR-21快了约11倍。更重要的是，当互补长度从7 nt（t7_6s）增加到8 nt（t8_7s，覆盖g2-g8）时，miRISC对靶标的亲和力（以K_D衡量）提高了约8倍，而这种效应在游离miRNA中不明显，表明miRISC的组织使得至少7个连续碱基对（覆盖g2-g8）对于稳定靶标结合至关重要，这与功能研究结果一致。有趣的是，延长互补至9 nt（t9_7s）虽然显著降低了解离速率常数（k_dis），但结合速率常数也同步下降，导致亲和力仅略有增加（约2倍）。当互补进一步延伸到中央区域（g9-g12）时，三元复合物的稳定性反而逐渐降低，推测是由于较长的靶标序列与Ago2的中央裂隙产生不利的空间位阻。而互补延伸到补充区域（g13-g16）时，复合物稳定性有所增加，但结合速率常数显著减慢，总体亲和力仅比单纯的种子区匹配（t8_7s）提高了约3倍。这些结果解释了为什么在哺乳动物中，靶标互补性通常只保守到g8，而g9之后的互补对亲和力贡献有限，因此进化压力下未被广泛保守。

稳定的5'种子区靶标相互作用在miRISC中间歇性被抑制

对单个miRISC分子结合轨迹的深入分析揭示了显著的动力学异质性。结合事件并非随机的泊松过程，而是表现出“爆发”（burst）行为，即一段时间内高频结合（爆发期）与另一段时间内低频或无结合（非爆发期）交替出现。这种爆发行为表明miRISC的5'S可及性并非恒定，而是存在缓慢的（时间尺度为数十秒）构象波动，周期性地允许或抑制靶标结合。研究人员推测，这反映了Ago2蛋白内部（特别是α-螺旋7）固有的构象平衡，在有利于稳定种子结合的构象（a7'）和不利于结合的构象（a7）之间自发转换。这种内在的动态性可能有助于miRISC避免与靶标过度稳定结合，促进转换效率，并可能参与靶标选择性。

miRISC的构象灵活性控制着不依赖种子区的3'非种子区与靶标相互作用

接下来，研究团队探索了不依赖于5'S的3'NS靶向机制。他们使用了互补于miR-21的补充区域和3'NS区域（g13-g22）、但完全不涉及5'S的靶标模拟物（长度7-10 nt）。令人惊讶的是，SiMKEPS检测到了这些探针与miR-21 RISC的特异性结合，并且动力学特征呈现出两个明显不同的群体：一个群体表现为快速、瞬时的结合（瞬时结合组分），其结合速率常数远快于游离miRNA，表明Ago2同样预组织了3'NS区域以便快速靶标探查；另一个群体则表现为缓慢、长寿命的结合（长寿命结合组分），其动力学与游离miRNA的简单杂交相似。对于瞬时结合组分，其解离速率常数在8-10 nt互补范围内几乎不变，且结合寿命极短，提示Ago2的陪伴使得3'NS不能完全稳定配对，可能因为其3'末端仍与PAZ结构域结合。而对于长寿命结合组分，其解离速率常数随互补长度增加而减慢，符合常规RNA杂交规律，表明其3'末端可能已从PAZ结构域解离。随着互补长度的增加，长寿命结合组分的比例也随之增加，支持了更广泛的3'NS配对能促进PAZ解离的假说。此外，3'NS结合也表现出爆发行为，暗示其可及性同样受缓慢的构象 fluctuations 调控。

miRISC呈现具有互斥性5'S和3'NS可及性的多种稳定状态

最关键的部分在于探究5'S和3'NS的结合是否相互关联。通过双色SiMKEPS和smFRET实验同时观察种子区探针（Cy3标记）和非种子区探针（Cy5标记）与同一miRISC的结合情况，研究人员发现，绝大多数（约97%）显示瞬时3'NS结合的miRISC分子完全不显示5'S结合，表明这两种结合模式是相互排斥的，对应于Ago2的不同构象状态。然而，相当一部分（约20%）显示长寿命3'NS结合的miRISC分子也同时显示5'S结合。smFRET实验进一步证实，当使用更长的非种子探针（如t10_NS）时，同时观察到种子和非种子结合（表现为FRET信号）的分子比例更高，说明在5'S可及的miRISC构象中，如果3'NS与靶标形成足够多的碱基对，可以诱导3'末端从PAZ结构域解离，从而实现两个区域的同时结合。综合这些发现，研究人员提出，细胞内miRISC存在多个稳定的构象状态：约70%的复合物处于5'S可及状态（传统通路）；约25%的复合物处于3'NS可及但5'S不可及的状态（非经典通路），其中部分（瞬时结合）的3'末端仍与PAZ结合，部分（长寿命结合）的3'末端已从PAZ解离；还有一部分可以实现5'S和3'NS的同时结合。

这项研究通过创新的单分子技术，揭示了miRISC靶向mRNA的复杂性和多样性，提出了一个超越传统两步模型的统一框架。该模型成功地调和了先前看似矛盾的研究发现：一方面，它确认了5'S引导的靶向是主要且高效的途径；另一方面，它证实了确实存在一条不依赖于5'S、直接由3'NS介导的替代性靶向通路，尽管其效率较低，这解释了CLASH等研究中发现的非经典相互作用。更重要的是，该研究揭示了Ago2蛋白固有的构象动力学是调控不同靶向模式的关键，其α-螺旋7和PAZ结构域的协同运动决定了种子区和非种子区的可及性。这一模型深化了我们对microRNA调控基因表达分子机制的理解，为理性设计基于RNA干扰的疗法提供了新的理论基础和潜在的靶点。例如，针对特定构象状态的miRISC进行干预，可能提高治疗的特异性和效果。未来，研究不同miRNA序列、Ago蛋白亚型以及细胞特定修饰对miRISC构象平衡的影响，将进一步丰富和完善这一模型，推动RNA沉默技术在生物医学领域的更广泛应用。