炎症特异性DNA折纸纳米器件递送siRNAs治疗溃疡性结肠炎

《Nature Communications》：Inflammation-specific DNA origami nanodevice for delivery of siRNAs to treat ulcerative colitis

溃疡性结肠炎(UC)治疗面临siRNA靶向递送与可控释放难题。本研究开发了一种基于DNA折纸技术的智能纳米器件，其能响应炎症细胞中易位的APE1酶，实现siRNA在肠道炎症部位的精准释放。该器件可同时负载靶向TNF-α和整合素α4的siRNAs，通过特异性沉默致病基因、抑制NF-κB通路、清除活性氧等多重机制，在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中实现100%存活率，展现出优越的治疗效果和生物安全性，为UC的联合治疗提供了新策略。

　　

在医学研究的前沿领域，溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）作为一种慢性、复发性炎症性肠病，始终是困扰患者和医生的难题。传统的治疗方法往往效果有限，且可能伴随显著副作用。近年来，基于RNA干扰（RNAi）技术的小干扰RNA（siRNA）疗法展现出巨大潜力，它能够精准地沉默特定的致病基因。然而，如何将脆弱的siRNA安全、高效地递送到肠道炎症部位，并仅在病变细胞中智能释放，同时避免对健康组织造成影响，是横亘在科学家面前的重大挑战。现有的递送载体，如脂质或聚合物纳米颗粒，往往在肝脏或肾脏中富集，难以有效靶向肠道，且存在脱靶风险，可能引发不必要的免疫反应。

面对这一困境，DNA纳米技术，特别是结构精确可编程的DNA折纸（DNA origami）技术，为构建智能药物递送系统带来了曙光。这类结构能够像“纳米机器人”一样，保护药物在血液循环中不被降解，并在到达特定部位后，响应局部微环境信号（如特定的酶、pH值或小分子）而改变构象，从而释放其携带的治疗载荷。然而，溃疡性结肠炎的炎症微环境与肿瘤等其他疾病环境存在本质区别，亟需一种能够特异性响应肠道炎症、实现精准药物释放的智能纳米器件。

正是在这一背景下，张天赐、李若晴等研究人员在《自然-通讯》（Nature Communications）上发表了他们的最新研究成果。他们巧妙地利用了一种在炎症细胞中发生特异性易位的酶——脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（APE1），作为触发开关。在正常细胞中，APE1主要位于细胞核内，执行DNA修复功能；而当细胞转向炎症状态时，APE1会从细胞核易位到细胞质中。研究团队设计了一种包含AP位点（无嘌呤/无嘧啶位点）的DNA双链结构，称为“AP锁”（AP locker）。该“锁”能够被细胞质中的APE1特异性切割。基于此，他们构建了一种酶响应的DNA折纸纳米器件：该器件在正常状态下是一个封闭的管状结构，将治疗性siRNA（靶向肿瘤坏死因子-α TNF-α和整合素α4 integrin α4）隐藏在其空腔内，保护其在血液循环中的稳定性；当纳米器件到达炎症肠道并被炎症细胞内化后，胞质中高浓度的APE1会切割“AP锁”，导致纳米器件从管状展开为平面片层结构，从而暴露siRNA，进而发挥基因沉默作用，抑制炎症。

为开展此项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术：利用DNA折纸技术精准组装矩形纳米片并可控负载siRNA；通过原子力显微镜（AFM）和琼脂糖凝胶电泳（AGE）表征纳米结构；采用酶切实验和细胞成像验证APE1触发的纳米器件解锁；通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western Blot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等在细胞和动物（C57BL/6J小鼠，购自斯佩福生物公司）水平评估基因沉默效果及抗炎机制；借助小动物活体成像系统分析纳米器体的体内分布；通过苏木精-伊红（H&E）染色、免疫组织化学/免疫荧光染色以及疾病活动指数（DAI）和组织学评分评估小鼠结肠炎模型的治疗效果。

设计并表征纳米器件

研究人员首先设计了一种尺寸为100 x 70 x 2 nm3的矩形DNA折纸纳米片，其表面预设了捕获链，可精确装载特定数量的siTNF-α和siIntegrin α4。通过荧光定量和AFM成像等手段，证实siRNA能够以可控的数量和比例成功装载到纳米片上。随后，利用设计的“AP锁”结构，将负载siRNA的平面纳米片卷曲成管状纳米器件。AFM显示其高度约为4 nm（约为纳米片的两倍），证实了成功构建了预设的管状结构，该结构有助于在血液循环中屏蔽和保护siRNA。

APE1触发的酶响应性解锁

研究证实，“AP锁”能被APE1有效切割。当纳米器件被Cy3（荧光基团）和BHQ2（淬灭基团）标记的“AP锁”锁定时，Cy3荧光被淬灭；加入APE1后，荧光逐渐恢复，表明“AP锁”被切开。AGE和AFM分析进一步显示，加入APE1后，纳米器件的迁移速率变慢，形貌从管状变为平面，高度降至约2 nm。在细胞实验中，他们发现APE1在脂多糖（LPS）诱导的炎症细胞（RAW264.7巨噬细胞）中从细胞核易位至细胞质。将标记的纳米器件与正常或炎症细胞共孵育后，仅在炎症细胞中观察到强烈的Cy3荧光信号（表明解锁），而纳米器件本身的摄取水平在两类细胞中相似。这证明该纳米器件能特异性响应炎症细胞中的APE1而被解锁。

纳米器件在炎症细胞中展现出强大的基因沉默能力

细胞摄取实验表明，自由的siRNA难以进入人结肠腺癌细胞（Caco-2），而纳米器件则能通过清道夫受体或小窝蛋白介导的内吞途径有效递送siRNA进入细胞质，且部分能逃离溶酶体降解途径。基因和蛋白水平检测（RT-qPCR和Western Blot）显示，纳米器件能有效降低LPS处理的炎症细胞中TNF-α和整合素α4的mRNA和蛋白表达，而在正常细胞中则无明显影响，表明其“在炎症细胞中激活，在正常细胞中惰性”的特性。此外，纳米器件还能有效抑制NF-κB信号通路的激活（表现为抑制IκB和p65的磷酸化）及其下游炎症因子IL-1β和IL-6的表达。同时，研究发现基于DNA的纳米结构本身具有良好的活性氧（ROS）清除能力，且对细胞无明显毒性，显示出其在缓解UC氧化应激方面的潜力。

纳米器体的体内分布

小动物活体成像显示，静脉注射后，纳米器件能选择性地在肠道（无论是健康还是炎症状态）富集，并在24小时内保持较高信号，而在其他主要器官（心、肝、脾、肺、肾、胰腺）中积累较少。不同形状DNA折纸的比较表明，管状结构在肠道积累略有优势。结肠组织切片荧光成像证实纳米器件能被肠道细胞摄取，且在结肠炎小鼠肠道中的信号更强。同时，实验也证实纳米器件能有效将两种siRNA递送至肠道组织。

纳米器件在体内展现出强大的治疗效果和生物安全性

在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中，纳米器件治疗组表现出100%的存活率，并能显著逆转体重下降和结肠缩短，结肠长度恢复至正常组的83%。疾病活动指数（DAI）和组织学评分均显著改善，结肠组织形态接近正常，炎症浸润最轻。值得注意的是，不负载siRNA的单纯DNA纳米管（Nanotube）也显示出一定的保护效果，这归因于DNA结构本身的ROS清除作用，降低了结肠组织中的丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）水平。纳米器件治疗组未观察到对肝、肾的毒性，血清生化指标正常，表现出良好的体内生物安全性。

纳米器件抑制肠道炎症和T细胞归巢

机制研究表明，纳米器件能显著降低结肠组织中TNF-α和整合素α4的基因和蛋白表达。TNF-α的下调抑制了巨噬细胞向炎症部位的募集；整合素α4的下调则削弱了其与配体MAdCAM-1的结合，从而阻碍T细胞向肠道的归巢。免疫荧光染色证实，纳米器件治疗显著减少了肠道中巨噬细胞（F4/80+）和T细胞（CD3+）的浸润，以及中性粒细胞浸润标志物MPO的活性。同时，NF-κB通路激活被抑制，下游炎症因子IL-1β和IL-6表达下降。此外，纳米器件治疗还明显抑制了肠道上皮细胞（IECs）的凋亡（cleaved-caspase 3表达下降），并恢复了肠道屏障功能（紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达回升）。

综上所述，这项研究成功开发了一种智能响应型DNA折纸纳米器件，用于溃疡性结肠炎的联合治疗。该器件的创新性在于巧妙利用了炎症特异性标志物APE1的亚细胞易位作为分子开关，实现了siRNA在病变部位的按需释放，同时最大限度地减少了对健康组织的脱靶效应。其卓越的肠道靶向能力、强大的基因沉默效果、多机制抗炎（抑制NF-κB通路、清除ROS、抑制免疫细胞浸润）以及良好的生物安全性，共同促成了其在动物模型中的出色治疗效果。这项工作不仅为溃疡性结肠炎提供了一种有前景的新型治疗策略，也展示了DNA纳米技术在构建智能药物递送系统、实现精准医疗方面的巨大潜力。该纳米器件作为一个可编程的平台，未来或可通过加载不同的治疗性核酸分子，应用于其他炎症性或自身免疫性疾病的治疗。