血小板反应蛋白-4通过调控血管平滑肌细胞凋亡在动脉移植静脉后血管重塑中的关键作用及机制研究

《Scientific Reports》：Thrombospondin-4 regulates apoptosis of vascular smooth muscle cells after artery transplanted into vein

本研究针对冠状动脉搭桥术后静脉移植物内膜增生难题，创新性地建立动脉移植至静脉的力学卸载模型，首次整合转录组学与蛋白质组学分析，发现THBS4在低张力环境下通过整合素α6-FAK-PI3K-RAC-PAK1信号轴调控血管平滑肌细胞凋亡。该研究为靶向THBS4防治血管再狭窄提供了全新理论依据。

　　

在心血管外科领域，冠状动脉搭桥术（CABG）虽能显著改善患者预后，但术后移植物失效问题始终困扰着临床医生。尤为矛盾的是，动脉移植物表现出卓越的长期通畅率，而作为临床主力的静脉移植物却在10年内有高达50%的失败率，其主要病理基础是内膜增生。这种差异背后的分子机制一直未被阐明，成为制约CABG疗效提升的关键瓶颈。

有趣的是，动脉特有的高血压、高张力环境似乎是诱发内膜增生的"催化剂"——正常状态下不易发生病变的静脉一旦移植至动脉环境，便会迅速出现内膜增生。反之，当动脉被移植至低压力的静脉环境时，又会发生什么变化？这个看似与临床实践相悖的科学问题，却可能揭示血管适应性重塑的核心规律。此前研究发现，动脉移植至静脉后会发生萎缩性重塑且不出现动脉粥样硬化，提示机械力学卸载可能通过诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）凋亡来抑制增生性病变。然而，这一过程的具体分子开关尚未被揭示。

发表在《Scientific Reports》的这项研究首次通过多组学技术破解了这一谜题。研究人员创新性地将新西兰白兔的颈总动脉（RCCA）移植至颈外静脉（REJV），建立动脉力学卸载模型，并通过超声证实移植动脉确实转变为低阻力、低血流状态。

组织学分析显示，移植动脉血管壁随时间推移逐渐变薄，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性细胞数减少，透射电镜观察到VSMCs从收缩表型向合成表型转化。TUNEL染色证实血管中膜细胞凋亡是血管萎缩的主要机制，且在术后7天达到高峰。

研究的关键突破在于整合转录组和蛋白质组分析：术后14天的转录组检测发现2999个基因上调、2029个基因下调，而术后30天的蛋白质组数据确认643个差异表达蛋白。两组数据共同指向血小板反应蛋白-4（THBS4）的显著上调以及黏着斑通路的下调。

免疫组化验证THBS4在术后7天表达最高，主要定位于细胞质和细胞核。

为验证THBS4功能，研究人员在体外人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）中进行过表达和沉默实验。流式细胞术显示THBS4过表达使细胞凋亡率从8.9%升至47.4%，并将细胞阻滞在S期；而沉默THBS4未引起显著变化。

机制研究表明，低拉伸应力（5%）能显著上调THBS4表达并促进HASMCs凋亡，而正常（10%）和高拉伸应力（15%）下此效应减弱。

IPG通路分析揭示THBS4通过整合素α6（ITGA6）-FAK-PI3K-RAC-PAK1信号轴调控凋亡，Western blot证实THBS4过表达能激活p-PAK1。

关键技术方法

研究采用新西兰白兔动脉移植静脉模型，通过血管吻合轮实现颈总动脉与颈外静脉端端吻合。运用超声影像学评估血流动力学变化，组织化学染色（H&E、免疫组化、免疫荧光）分析形态学改变，透射电镜观察超微结构，TUNEL检测细胞凋亡。整合转录组测序和DIA蛋白质组学技术筛选差异表达基因/蛋白，通过iPathway Guide进行生物信息学分析。体外实验采用人主动脉平滑肌细胞系，通过质粒转染和siRNA干扰调控基因表达，Flexcell应力加载系统模拟机械拉伸，流式细胞术分析凋亡与细胞周期。

2.1 移植后血管形态学变化

通过超声证实移植动脉转变为低阻力、低血流状态。组织学显示血管中膜厚度随时间显著变薄，α-SMA阳性细胞减少，细胞核数量减少，表明VSMCs丢失。超微结构显示VSMCs从收缩表型向合成表型转化，最终出现弹性板断裂。TUNEL证实血管中膜细胞凋亡是萎缩主因。

2.2 移植动脉的转录组分析

术后14天转录组发现2999个上调基因和2029个下调基因。THBS4是上调最显著的基因之一。KEGG和GO分析均显示黏着斑通路显著富集，且该通路中多个凋亡相关基因（PARVA、VCL、MYLK等）下调。

2.3 移植动脉的蛋白质组分析

术后30天蛋白质组确认643个差异表达蛋白，THBS4蛋白表达上调4.18倍。功能富集再次验证黏着斑通路变化，且该通路中凋亡相关蛋白（VCL、MYLK、PARVA等）均下调。

2.4 THBS4促进HASMCs凋亡

过表达THBS4使HASMCs凋亡率显著升高，并将细胞阻滞在S期；沉默THBS4无显著影响，表明THBS4在正常状态下低表达，仅在组织重塑等特定状态下被激活。

2.5 低拉伸应力促进THBS4表达和HASMCs凋亡

5%低拉伸应力下THBS4基因和蛋白表达最高，细胞凋亡率也最高（47.1%），随着拉伸应力增加（10%、15%），THBS4表达和凋亡率均下降，证实机械应力通过THBS4调控凋亡。

2.6 THBS4通过黏着斑通路与PAK1相互作用调控VSMCs凋亡

IPG分析提示THBS4通过ITGA6-FAK-PI3K-RAC-PAK1信号轴调控凋亡。实验证实THBS4过表达激活p-PAK1，沉默则抑制p-PAK1。

研究结论与意义

该研究首次在动脉力学卸载模型中整合多组学技术，发现THBS4是调控VSMCs凋亡的关键分子。其创新性在于：阐明低机械应力通过上调THBS4表达，进而通过黏着斑通路促进VSMCs凋亡的机制；发现THBS4对VSMCs具有促凋亡和周期阻滞的双重作用；揭示THBS4表达受机械应力调控的特性。

这项研究不仅解释了动脉移植至静脉后发生萎缩性重塑的分子机制，更重要的是为防治血管再狭窄提供了新靶点。理论上，通过调控THBS4表达可能实现VSMCs凋亡与增殖的精准平衡，为解决CABG术后静脉移植物失效这一临床难题提供了全新策略。此外，THBS4在不同机械环境中的差异性表达规律，为理解力学信号转导提供了新视角。