携带CLEC17A碳水化合物识别域的嵌合病毒样颗粒显著降低罗氏沼虾野田病毒在Sf9细胞中的感染

《Scientific Reports》：Chimeric virus-like particles carrying the CLEC17A carbohydrate-recognition domain significantly reduce Macrobrachium rosenbergii nodavirus infection in Sf9 cells

本研究针对罗氏沼虾野田病毒（MrNV）通过宿主细胞岩藻糖基化聚糖介导感染的关键机制，创新性地构建了嵌合病毒样颗粒（CLEC17A/CRD-MrNV-VLPs）。研究人员通过替换病毒衣壳蛋白P结构域为人类凝集素CLEC17A的碳水化合物识别域（CRD），成功获得稳定性高且能特异性结合岩藻糖基化聚糖的纳米颗粒。实验证实该颗粒可竞争性抑制MrNV与Sf9细胞结合，使病毒RNA拷贝数下降约99.3%，为水产养殖病毒防控提供了新型纳米干预策略。

　　

在罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）养殖业中，白尾病（White tail disease, WTD）是导致虾苗大规模死亡的毁灭性病害，其病原体罗氏沼虾野田病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus, MrNV）可通过水体快速传播。该病毒属于野田病毒科（Nodaviridae），具有无包膜、单股正链RNA（ssRNA+）结构，其T=3二十面体衣壳由180个衣壳蛋白亚基组成。既往研究表明，MrNV入侵宿主细胞的关键步骤依赖于病毒衣壳蛋白C末端的突出结构域（P-domain）与宿主细胞表面的岩藻糖基化 LacdiNAc（LDNF）聚糖特异性结合。尤其值得注意的是，Sf9昆虫细胞作为易感模型，其表面富含的岩藻糖基化N-/O-聚糖是病毒吸附的重要分子靶点。若能阻断这一糖-病毒相互作用，将有望开发出新型抗病毒策略。

为破解这一难题，泰国玛希隆大学解剖学系Monsicha Somrit团队在《Scientific Reports》发表最新研究，创新性地利用MrNV病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs）的自组装特性，构建了携带人类凝集素CLEC17A碳水化合物识别域（Carbohydrate-recognition domain, CRD）的嵌合纳米颗粒（CLEC17A/CRD-MrNV-VLPs）。该设计旨在通过CRD域的高亲和力竞争性结合宿主细胞岩藻糖基化聚糖，从而阻断MrNV的感染途径。

研究团队采用以下关键技术方法：首先通过生物信息学工具（PHYRE2、UCSF ChimeraX）预测结构可行性；利用基因工程截短野生型MrNV衣壳蛋白P结构域，获得无突起VLPs（V250-MrNV-VLPs）作为支架；将CLEC17A的CRD域通过柔性链接肽（GSGGSG）替换P结构域，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并通过镍柱亲和层析纯化；通过透射电镜（TEM）验证颗粒组装；采用ELISA分析嵌合VLPs与岩藻糖基化抗原（Lewis Y、Sia-Le^x等）的结合能力；以Sf9细胞为模型，通过免疫荧光、RT-PCR和qRT-PCR评估其对活病毒（MrNV分离自患病虾苗）感染的抑制效果。

结构建模证实P结构域替换的可行性

通过同源建模显示，CLEC17A CRD（残基257-395）可成功替换MrNV P结构域（残基251-374），形成亚基分子量约45 kDa的嵌合衣壳蛋白。二十面体结构预测表明，嵌合VLPs表面突起形态不同于野生型MrNV-VLPs的片状结构或V250-MrNV-VLPs的光滑表面，而呈现CRD特有的突起特征，且无严重空间冲突。

截断P结构域产生无突起的二十面体颗粒

截除P结构域（残基251-374）后获得的V250-MrNV-VLPs直径缩小至20-22 nm，电镜显示其表面光滑且仍保持二十面体对称性，为后续CRD域插入提供了稳定支架。

CLEC17A/CRD-MrNV衣壳蛋白成功自组装为VLPs

SDS-PAGE和Western blot验证嵌合蛋白分子量为45 kDa，且能被抗六组氨酸标签和抗CLEC17A CRD抗体特异性识别。电镜观察显示CLEC17A/CRD-MrNV-VLPs为直径30-32 nm的二十面体颗粒，表面可见CRD突起，表明CRD域完整保留且不影响颗粒组装。

CLEC17A/CRD-MrNV-VLPs对岩藻糖基化抗原具有高结合效率

ELISA实验表明，嵌合VLPs可特异性结合Lewis Y、Sia-Le^y等岩藻糖基化聚糖，结合效率显著高于野生型VLPs和V250-MrNV-VLPs，证实CRD域赋予其靶向岩藻糖基化聚糖的能力。

嵌合VLPs显著降低MrNV与Sf9细胞裂解物的结合

预孵育CLEC17A/CRD-MrNV-VLPs可使野生型MrNV-VLPs与Sf9细胞裂解物的结合降低82.91%，表明其可竞争性占据病毒结合位点。

CLEC17A/CRD-MrNV-VLPs显著降低Sf9细胞中MrNV感染水平

共聚焦显微镜显示预处理嵌合VLPs的细胞中MrNV红色信号显著减弱。RT-PCR和qRT-PCR分析表明，MrNV RNA水平下降48.65%，病毒拷贝数减少约99.3%（从10^4.63降至10^2.45），证实其有效抑制病毒复制。

本研究首次证实CLEC17A/CRD-MrNV-VLPs可通过多价呈现CRD域高效竞争性阻断MrNV与宿主细胞岩藻糖基化聚糖结合。其意义在于：一方面为水产病毒病提供了新型纳米阻断剂；另一方面拓展了MrNV-VLPs作为生物支架的适用性，为后续携带更大功能域（如抗体、细胞因子）的纳米载体设计奠定基础。尽管Sf9细胞模型与真实宿主存在糖基化差异，且体内免疫原性尚未评估，但该策略为开发针对岩藻糖依赖型病毒（如某些冠状病毒）的通用干预平台提供了新思路。