溴敌隆联合环丙沙星、维生素D、阿司匹林和肉桂作为凋亡介导的鼠害防治策略的评估}

《Scientific Reports》：Evaluation of bromadiolone combined with ciprofloxacin, vitamin D, aspirin, and cinnamon as an apoptosis-mediated rodenticide strategy

本研究针对传统抗凝血类灭鼠剂使用剂量高、环境风险大等问题，创新性地探讨了将溴敌隆(Bromadiolone)与环丙沙星(Ciprofloxacin)、维生素D(Vitamin D)、阿司匹林(Aspirin)及肉桂(Cinnamon)联用，通过诱导氧化应激、DNA损伤及p53-p21-半胱天冬酶(Caspase)通路介导的肝细胞凋亡，从而在降低溴敌隆用量的前提下增强其杀鼠效果。结果表明，尤其是肉桂的添加能显著增强促凋亡效应，为开发高效、低环境负荷的鼠害控制策略提供了新的 mechanistic 见解和实验依据。

　　

在全球范围内，鼠类不仅对农业生产造成巨大损失，如破坏棉花、甘蔗、谷物等多种作物，还是许多人畜共患病的传播媒介，对公共卫生安全构成严重威胁。目前，化学防治仍是控制鼠害最经济有效的手段之一，其中抗凝血类杀鼠剂，特别是第二代“超级华法林”如溴敌隆(Bromadiolone, BDL)，因其高效而广泛应用。然而，这类鼠药也伴随着日益突出的问题：一方面，鼠类可能产生抗药性；另一方面，溴敌隆在环境中残留时间长，对非靶标生物（如捕食鼠类的鸟类和兽类）构成二次中毒的威胁，同时误食鼠药导致的人类中毒事件也时有发生。因此，开发能够有效降低溴敌隆使用剂量、同时保持或增强其杀鼠效果的新策略，对于减少环境污染物负荷和降低生态风险具有紧迫的现实意义。

传统的溴敌隆通过抑制维生素K环氧化物还原酶，干扰维生素K依赖性凝血因子（II, VII, IX, X）的活化，导致动物凝血功能障碍和内出血死亡。近年来，研究者们开始探索将溴敌隆与其他具有不同作用机制的化合物联用，以期产生协同增效作用。例如，维生素D（胆钙化醇，Cholecalciferol）过量可引起高钙血症，导致组织钙化和肾功能损害；阿司匹林(Aspirin, ASA)作为非甾体抗炎药，除了解热镇痛外，也能抑制血小板聚集并可能诱导细胞凋亡；肉桂中含有的天然香豆素类成分本身也具有一定的维生素K拮抗活性；而抗生素环丙沙星(Ciprofloxacin)则被报道可能与华法林（另一种维生素K拮抗剂）发生相互作用，影响其抗凝效果。尽管这些化合物各自的作用有所了解，但将它们系统性地与溴敌隆组合，并深入研究其对机体氧化应激、DNA损伤、细胞凋亡信号通路以及组织病理学的综合影响，此前尚属空白。

为此，研究人员在《Scientific Reports》上发表了题为“Evaluation of bromadiolone combined with ciprofloxacin, vitamin D, aspirin, and cinnamon as an apoptosis-mediated rodenticide strategy”的研究论文。该研究旨在评估上述组合能否通过激活凋亡通路，从而在降低溴敌隆用量的情况下，实现对野生褐家鼠(Rattus norvegicus)的有效控制。

为了回答上述问题，研究人员开展了一项系统的实验研究。他们首先通过阶梯法测定了溴敌隆对野生雄性褐家鼠的半数致死剂量(LD₅₀)，确定为1.6 mg/kg体重。随后，研究人员将63只大鼠随机分为7个实验组，包括对照组、溶剂对照组、单独溴敌隆组(1/2 LD₅₀, 0.8 mg/kg)以及四个溴敌隆联合用药组（分别添加环丙沙星、环丙沙星+维生素D、环丙沙星+维生素D+肉桂、环丙沙星+维生素D+阿司匹林），通过口服途径连续给药21天。研究结束时，通过宰杀方式处死动物并收集样本。

本研究运用了多项关键技术方法：通过蛋白质免疫印迹(Western Blot)技术检测肝脏组织中p21和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平，以评估细胞周期阻滞和凋亡执行情况；采用免疫组织化学方法检测p53蛋白的定位与表达；通过单细胞凝胶电泳实验（彗星实验，Comet Assay）评估肝细胞DNA损伤程度；利用吖啶橙(Acridine Orange, AO)荧光染色在荧光显微镜下观察和计数凋亡细胞；使用全自动血液分析仪和商用试剂盒检测血清中的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、离子钙(Ca²⁺)、红细胞(RBCs)、血红蛋白(Hgb)和凝血酶原时间(PT)等生化指标；通过生化法测定肝组织匀浆中的脂质过氧化(LPO)水平和还原型谷胱甘肽(GSH)含量以评估氧化应激状态；并对肝组织切片进行苏木精-伊红(H&E)染色，进行半定量的组织病理学损伤评估。

Western blot分析P21和Cleaved Caspase-3蛋白水平

研究人员通过Western blot检测了肝脏中与细胞周期阻滞和凋亡密切相关的蛋白P21和Cleaved Caspase-3的水平。结果显示，与对照组相比，所有处理组的P21和Cleaved Caspase-3蛋白表达均显著上调。其中，单独溴敌隆组(B)的P21和Cleaved Caspase-3分别增加了96.65%和75.92%。而联合用药组的效果更为显著，尤其是溴敌隆+环丙沙星+维生素D+肉桂组(B+Anti+Vit. D+Cin)，P21和Cleaved Caspase-3的表达分别增加了惊人的264.23%和172.08%，表明肉桂的加入极大地增强了溴敌隆诱导的细胞周期阻滞和凋亡信号。溴敌隆+环丙沙星+维生素D+阿司匹林组(B+Anti+Vit. D+A)也显示出强烈的促进作用（P21增加225.68%，Cleaved Caspase-3增加149.53%）。这些数据表明，溴敌隆与这些添加剂联用，特别是与肉桂联用，能有效激活肝细胞内的凋亡通路。

P53的免疫组织化学检测

p53是一个重要的肿瘤抑制蛋白，在DNA损伤应答和细胞凋亡中起核心作用。免疫组化结果显示，对照组肝细胞的p53染色呈阴性或极弱。单独溴敌隆处理组(B)的p53水平比对照组增加了60.74%，但无统计学显著性。而各联合用药组则呈现出剂量依赖性的p53表达增加。溴敌隆+环丙沙星组(B+Anti)、溴敌隆+环丙沙星+维生素D组(B+Anti+Vit. D)、溴敌隆+环丙沙星+维生素D+肉桂组(B+Anti+Vit. D+Cin)和溴敌隆+环丙沙星+维生素D+阿司匹林组(B+Anti+Vit. D+A)的p53水平分别显著增加了111.72%、157%、424.16%和262.69%。p53的强烈激活，尤其是在肉桂组，提示严重的DNA损伤应激，进而可能通过转录激活其下游靶基因（如p21）来诱导细胞周期停滞和凋亡。

彗星实验评估DNA损伤

为了直接评估肝细胞的DNA损伤情况，研究人员进行了彗星实验，并分析了橄榄尾矩(OTM)、尾矩(TM)、尾部DNA百分比(T.DNA%)和尾长(TL)等参数。所有处理组均表现出显著的DNA损伤。单独溴敌隆组(B)的OTM、TM、T.DNA%和TL分别增加了710.02%、506.09%、222.35%和155.04%。联合用药再次显示出更强的基因毒性，其中溴敌隆+环丙沙星+维生素D+肉桂组(B+Anti+Vit. D+Cin)的损伤最为严重，上述四项参数分别急剧增加了3383.08%、1490.61%、756.17%和466.25%。溴敌隆+环丙沙星+维生素D+阿司匹林组(B+Anti+Vit. D+A)的损伤程度次之。彗星实验的结果直观地证实，溴敌隆及其组合物，特别是含有肉桂的组合，能引起肝细胞DNA的严重链断裂。

吖啶橙荧光染色评估细胞凋亡

通过吖啶橙(AO)荧光染色可以区分正常细胞和凋亡细胞。正常细胞核呈现均匀的淡绿色荧光，而早期凋亡细胞因染色质凝集，核内出现明亮的绿色荧光点，晚期凋亡细胞核则呈现致密的亮绿色或核碎裂。对照组和溶剂对照组仅见少量死细胞，绝大多数为正常细胞。各处理组的正常细胞数量显著减少，凋亡细胞数量显著增加。例如，溴敌隆+环丙沙星+维生素D+肉桂组(B+Anti+Vit. D+Cin)的正常细胞减少了77.63%，而凋亡细胞增加了431.93%。显微镜下观察到了明显的凋亡形态学特征，如核固缩(Pyknosis)以及致密、明亮的绿色染色质，特别是在添加了肉桂的组别中，这些现象最为普遍和严重，表明细胞凋亡被强烈诱导。

生化指标分析

血清生化指标检测显示，各处理组的肝损伤标志物AST和ALT活性均有所升高，其中溴敌隆+环丙沙星+维生素D+肉桂组(B+Anti+Vit. D+Cin)的AST和ALT分别比对照组升高了168.56%和97.08%，表明肝细胞膜受损或通透性增加。由于添加了维生素D，所有含维生素D的处理组血清钙离子(Ca²⁺)浓度均显著升高，溴敌隆+环丙沙星+维生素D+肉桂组(B+Anti+Vit. D+Cin)的血钙水平升高了402.59%，提示严重的高钙血症，这可能加重组织损伤和代谢性钙化。血液学检查发现，各处理组的红细胞(RBCs)计数和血红蛋白(Hgb)浓度均显著下降，凝血酶原时间(PT)则极度延长。例如，溴敌隆+环丙沙星+维生素D+肉桂组(B+Anti+Vit. D+Cin)的PT延长了1116.71%，这明确反映了溴敌隆及其组合物对维生素K依赖性凝血因子合成的强烈抑制，导致严重的凝血功能障碍和出血倾向。

肝组织氧化应激指标与组织病理学分析

在氧化应激方面，所有处理组的抗氧化剂还原型谷胱甘肽(GSH)水平均显著降低，而脂质过氧化(LPO)产物则显著增加。溴敌隆+环丙沙星+维生素D+肉桂组(B+Anti+Vit. D+Cin)的GSH下降了63.24%，LPO升高了264.38%，表明肝脏经历了严重的氧化应激。肝组织H&E染色切片的结构观察和半定量评分结果与生化指标和分子检测结果高度一致。对照组肝脏结构基本正常。单独溴敌隆组(B)可见肝细胞浓缩、胞浆空泡化、中央静脉充血和细胞浸润。随着添加物的增多，肝损伤进行性加重。在损伤最严重的溴敌隆+环丙沙星+维生素D+肉桂组(B+Anti+Vit. D+Cin)，观察到肝脏结构丧失、脂肪沉积、出血、血管周围增厚、坏死区域，以及典型的坏死特征如核固缩、核碎裂(Karyorrhexis)和核溶解(Karyolysis)。这些病理改变清晰地展示了联合用药，特别是含肉桂的方案，对肝脏造成的严重损害。

本研究通过多层次的实验证据表明，将溴敌隆与环丙沙星、维生素D、阿司匹林，特别是与肉桂组合，能够通过诱导强烈的氧化应激、造成严重的DNA损伤，进而激活p53-p21-Caspase-3信号通路，显著增强对野生褐家鼠肝细胞的凋亡诱导作用。这种协同增效作用使得在仅使用半数致死剂量(1/2 LD₅₀)的溴敌隆情况下，仍能对实验动物造成显著的生理、生化和组织病理学损害，其中以溴敌隆、环丙沙星、维生素D和肉桂的组合效果最为突出。

该研究的重要意义在于提出了一种潜在的鼠害控制新思路：通过将低剂量的传统抗凝血鼠药与具有不同辅助作用机制（如诱导高钙血症、促进氧化应激、增强凋亡信号）的化合物联用，可以实现有效控制鼠害的同时，大幅减少溴敌隆等持久性有机污染物在环境中的投放量，从而降低对非靶标生物和生态系统的风险。然而，研究人员也指出，这种组合策略的安全性，特别是对非靶标生物的潜在影响以及对环境的长期生态风险，仍需进行更深入、更全面的评估。此外，大样本的田间试验也是未来验证其实际应用价值的关键步骤。这项工作为开发更安全、更可持续的害虫综合治理(IPM)策略提供了有价值的实验数据和理论依据。