基于免疫信息学设计抗肠道寄生虫相关结直肠癌的多表位疫苗

《Scientific Reports》：Design of a multi-epitope vaccine against intestinal parasites associated with colorectal cancer using immunoinformatics approaches

本研究针对与结直肠癌相关的肠道寄生虫（隐孢子虫和血吸虫）感染缺乏有效疫苗的难题，采用免疫信息学方法，利用197个实验验证的表位设计了一种多表位疫苗MVCPSM。该疫苗通过分子对接、动力学模拟和免疫模拟证实其能与TLR受体稳定结合并激发强烈免疫反应，为寄生虫相关癌症的预防提供了新型候选疫苗。

　　

在全球范围内，胃肠道感染引起的疾病负担日益加重，其中由微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）和曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）引起的感染尤为突出。这两种寄生虫不仅导致急慢性肠道疾病，近年来的研究还发现，它们与结直肠癌的发生发展存在潜在关联。隐孢子虫作为一种人兽共患的细胞内原生动物，是引起人类隐孢子虫病的主要病原体之一。感染后，寄生虫通过抑制宿主干扰素-γ诱导的基因表达和降低α-防御素水平，逃避免疫清除，导致慢性炎症状态，进而可能促进免疫抑制性肿瘤微环境的形成。基因表达谱分析显示，隐孢子虫感染可导致Hedgehog、Wnt和p38/MAPK等癌症相关通路发生改变。而在血吸虫感染方面，曼氏血吸虫是最常见的人类血吸虫感染类型，尽管经过数十年的吡喹酮治疗和其他控制措施，血吸虫病仍然未被有效控制。曼氏血吸虫感染与肉芽肿性炎症和息肉形成有关，通常围绕钙化的血吸虫卵形成。直肠是血吸虫息肉的主要发生部位，乙状结肠次之。组织病理学检查显示息肉伴有肉芽肿性炎症，中心有大量钙化的血吸虫卵。研究表明，血吸虫卵分泌的因子可激活Wnt/β-连环蛋白信号通路和原癌基因c-Jun等致癌相关通路。虽然早期研究否认了血吸虫病与结直肠癌之间的关联，但越来越多的证据表明，慢性结肠血吸虫病可能促进结直肠癌的发展。

目前，针对隐孢子虫和血吸虫感染缺乏根治性治疗方法。硝唑尼特是FDA批准的唯一用于治疗隐孢子虫病的药物，但对免疫功能低下者效果有限。血吸虫病方面，尚无获批用于人类的疫苗。寄生虫疫苗开发面临诸多挑战，包括隐孢子虫基因组体外遗传修饰困难、无法在细胞培养系统中长期存活，以及血吸虫的多细胞性质和难以维持细胞培养等问题。如果寄生虫与人类癌症之间的因果关系得到最终确认，疫苗开发将成为预防大量消化系统癌症的关键策略。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，研究人员采用独特的计算策略，利用从IEDB数据库获得的197个实验验证的隐孢子虫和血吸虫表位，设计了一种针对这两种肠道寄生虫的多表位疫苗（MVCPSM）。与通常基于计算模型预测免疫表位的研究不同，本研究专门使用IEDB中实验验证的免疫表位来设计新型多表位抗原，提高了研究结果的可靠性和准确性，确保所选表位不仅具有理论相关性，而且在实际条件下已被证明能够触发免疫反应。

研究人员采用了一系列关键的技术方法开展研究：从IEDB数据库获取实验验证的表位并进行同源性筛选；使用免疫信息学工具进行疫苗构建设计及抗原性评估；通过分子对接分析疫苗与HLA等位基因和TLR受体的相互作用；利用分子动力学模拟评估疫苗-受体复合物的稳定性；采用免疫模拟预测疫苗的免疫原性；进行体外克隆验证疫苗在大肠杆菌中的表达潜力。

3.1. 表位的获取与筛选

研究共从IEDB获取了89个实验确定的曼氏血吸虫B细胞和HTL表位，以及108个微小隐孢子虫CTL表位。排除重复和非肽序列后，剩余177个独特表位。其中53个表位与人类蛋白质组具有>70%序列同源性，40个与人类微生物组蛋白质组具有>85%序列相似性，因此被剔除。对其余84个表位进行人群覆盖分析显示，7个CTL和7个HTL表位的全球人群覆盖率>30%。基于源抗原的细胞外定位，从两个抗原中筛选出5个B细胞表位作为候选表位。

3.2. 表位结构建模及与HLA等位基因的分子对接研究

分子对接分析显示，CTL表位与HLA I类分子具有强结合亲和力。NYKWWWFSF-HLA-A*24:02复合物显示最高对接得分（-115.4±4.3）。HTL表位也表现出强结合能力，FERQYKELQTQAEDDRR-HLA-DRB1 * 01:01复合物的对接得分最高（-116.3±3.5）。所有复合物均形成多个氢键和离子相互作用，有助于表位-HLA结合的稳定性。

3.3. HLA分子等位基因的人群分布研究

对HLA I类和II类等位基因的全球及区域分布分析显示，HLA I类在欧洲覆盖率最高（99.08%），中美洲最低（6.44%），全球覆盖率为97.44%。HLA II类等位基因的全球覆盖率为65.55%，欧洲最高（72.34%），南非最低（5.91%）。HLA I类和II类联合覆盖率在除中美洲（28.67%）外的所有区域均超过92%，总体全球覆盖率为99.12%。

3.4. MVCPSM的抗原性、安全性及理化特性评估

设计的MVCPSM由528个氨基酸组成，显示出良好的抗原性和安全性。VaxiJen v2.0评分分别为0.5741（无佐剂）和0.5509（有佐剂），均超过0.4的阈值。ANTIGENpro服务器进一步验证了其抗原性，得分高达0.928692。该构建体被预测为非过敏原性、非毒性且可溶性蛋白，溶解度得分为0.637622。GRAVY得分为-0.492，表明该嵌合抗原具有亲水性，可能增强其与免疫系统的溶解性和相互作用。分子量为57,357.48 Da，不稳定指数为36.99，预测MVCPSM稳定；脂肪族指数为67.82，表明其耐热且稳定。

3.5. 三级结构建模、优化及质量验证

I-TASSER服务器使用基于同源性的多线程方法生成了MVCPSM的五个三级结构。模型1的C得分为-1.56，被选择通过GalaxyRefine进行优化。优化后模型3显示出最佳质量指标：Ramachandran图中 favored区域残基百分比最高（85.7%），MolProbity得分最低（2.352），冲突得分较低（16.0）。初始模型的ERRAT质量因子得分为58.65，优化后显著提高至80.632，表明模型质量得到提升。

3.6. 不连续B细胞表位的结构预测

使用IEDB的ElliPro工具，在MVCPSM的优化三级模型中预测了7个不连续（构象）B细胞表位，得分在0.54至0.86之间。预测的表位长度从5到108个残基不等。

3.7. MVCPSM与TLRs的分子对接

对于MVCPSM与TLR2-TLR1的对接，HADDOCK 2.4将123个结构分为13个簇，占优化模型的61%。其中，簇1的HADDOCK得分最低（214.8±14.3），经HADDOCK优化后显著提高至-179.8±4.5。对于MVCPSM与TLR4-MD2的对接，143个结构被分为16个簇，占水优化模型的71%。簇1的最低初始HADDOCK得分为159.3±9.5，优化后提高至-191.5±3.4。MVCPSM与免疫受体复合物之间形成稳定的相互作用，由氢键和离子相互作用介导。

3.8. 免疫反应模拟

C-ImmSim服务器的免疫模拟表明，MVCPSM能够产生强大有效的免疫反应谱。每次注射后，抗原水平显著增加，然后在抗体水平上升时下降。二次和三次反应中的抗体浓度（IgG1、IgG2、IgG1+IgG2、IgM和IgM+IgG）显著高于初次反应。记忆B细胞持续存在超过100天。辅助性T细胞在第二次和第三次剂量期间保持高水平，表明持续的体液和细胞介导的免疫反应。细胞毒性T细胞也表现出强活性和记忆细胞形成。细胞因子产生，特别是IL-10、IL-12、TGF-β和IFN-γ，在所有三次注射后均增加。先天免疫反应通过巨噬细胞和树突状细胞数量的持续增加得到增强。

3.9. 分子动力学模拟

分子动力学模拟提供了复合物随时间变化的动态行为和相互作用信息。MVCPSM-TLR1-TLR2和MVCPSM-TLR4-MD2复合物的平均RMSD值分别为2.99±0.35 nm和2.84±0.21 nm。MVCPSM-TLR1-TLR2和MVCPSM-TLR4-MD2复合物的平均RMSF分别为0.21±0.11 nm和0.17±0.11 nm。MVCPSM-TLR1-TLR2复合物的平均Rg为4.68±0.05 nm，而MVCPSM-TLR4-MD2复合物为4.64±0.07 nm。SASA分析表明，平均SASA值对于MVCPSM-TLR1-TLR2复合物为518.36 nm2±5.91，对于MVCPSM-TLR4-MD2复合物为717.59 nm2±6.49。氢键分析显示，MVCPSM-TLR1-TLR2复合物平均形成20.11±5.35个氢键，而MVCPSM-TLR4-MD2复合物平均形成19.04±4.10个氢键。

3.10. 结合自由能计算

MVCPSM-TLR1-TLR2复合物的总结合自由能计算为-73.86±2.4 kcal/mol，而MVCPSM-TLR4-MD2复合物为-86.16±2.4 kcal/mol。在两种复合物中，气相能量（ΔG_Gas）显著为负，而范德华力（ΔVdW）和静电（ΔEEL）项对结合能产生最大的稳定作用。然而，极性溶剂化能量（ΔE_GB）不利于结合。

3.11. 密码子优化及体外克隆

MVCPSM氨基酸序列的反向翻译产生了一个1584 bp的cDNA。使用GenSmart密码子优化工具后，cDNA的GC含量调整为57.51%，落在30-70%的理想百分比范围内。XhoI和NdeI限制性位点分别掺入优化cDNA的C末端和N末端。然后使用SnapGene软件将优化后的插入片段克隆到pET-28a(+)载体中，产生总大小为6880 bp的重组质粒。

本研究通过免疫信息学方法设计了一种针对微小隐孢子虫和曼氏血吸虫的多表位疫苗MVCPSM。与以往通常基于计算模型预测免疫表位的研究不同，本研究专门使用IEDB中实验验证的免疫表位，提高了研究结果的可靠性和准确性。疫苗构建体包含7个CTL表位、7个HTL表位和5个B细胞表位，与RpfE佐剂和适当连接体组合，形成具有广泛全球覆盖范围的高度免疫原性嵌合抗原。该抗原显示出良好的抗原性、安全性、溶解性和稳定性。分子对接显示CTL和HTL表位与其各自HLA等位基因具有强结合亲和力。疫苗构建体与免疫受体（TLR2-TLR1和TLR4-MD2）的对接得分显著，分别为-179.8±4.5和-191.5±3.4 kcal/mol。分子动力学模拟验证了疫苗-受体复合物的结构稳定性，结合自由能计算强化了它们的强亲和力。免疫模拟证明该多表位抗原能够引发先天性和适应性免疫反应。体外克隆验证了疫苗在大肠杆菌中高效表达的潜力。

这些计算发现支持MVCPSM作为对抗微小隐孢子虫和曼氏血吸虫的有前途的疫苗候选物，值得进一步的实验验证。如果寄生虫与人类癌症之间的因果关系得到最终确认，疫苗开发将成为预防大量消化系统癌症的关键策略。未来的研究应侧重于使用重组DNA技术表达和纯化MVCPSM，并通过质谱和X射线晶体学验证其结构完整性。通过ELISA和ELISPOT在小鼠中进行免疫原性测试可以进一步验证预测的免疫反应。此外，评估MVCPSM对抗微小隐孢子虫和曼氏血吸虫感染的保护功效将是其临床应用的关键一步。