《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：CRISPR/Cas12a-based biosensors for foodborne mycotoxin detection: A review of current technologies and future prospects
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CRISPR/Cas12a技术快速灵敏检测食品中霉菌毒素的研究进展，分析生物识别、信号放大及检测方法，指出系统优化与现场适用性挑战，提出多模态信号输出和适配冷链运输的解决方案。
魏思怡|谢颖书|姜康妮|李志新|邓晓宇|徐少华|姜帆|陶英洲
中国中医药大学江西转化癌症技术工程研究中心及江西省中医药癌症诊断、治疗与康复重点实验室，南昌，江西，330004，中国
摘要
霉菌毒素污染对全球食品安全构成了持续威胁，因此迫切需要快速、灵敏且可在现场应用的检测技术。基于CRISPR/Cas12a的生物传感器成为满足这一需求的有前景的方法。本综述全面评估了这一动态领域的最新进展，系统分析了这些新型传感器的关键技术。我们从使用适配体和抗体的目标识别机制，到多种信号放大策略和读出方式进行了深入探讨。通过比较不同方法，我们确定了影响传感器性能的关键设计原则，并指出了可能阻碍实际应用的挑战。最终，本综述旨在为研究人员提供有价值的指导，概述了开发稳健的现场诊断工具以确保食品安全的重要考虑因素和未来发展方向。
引言
霉菌毒素是一类由真菌在适宜的温度和湿度条件下产生的有毒次级代谢产物[1]。它们广泛存在于各种食品中，包括谷物、坚果、豆类和油脂[[2], [3], [4]]。食品中最常见的霉菌毒素包括黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素M1（AFM1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、展青霉素（PAT）、赭曲霉毒素A（OTA）和玉米赤霉烯酮（ZEN）[[5], [6], [7]]。这些毒素具有不同程度的细胞毒性、遗传毒性和致癌性[8]。例如，AFB1被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物。这一分类是由于其强烈的肝毒性和致癌作用，对全球公共卫生构成了重大威胁。霉菌毒素污染可能发生在食品供应链的多个阶段，包括生产、加工、储存和运输，使其成为一种持续且普遍存在的食品安全问题[9]。因此，迫切需要开发快速、简单且可靠的检测方法，以便在各种环境中应用[10]。传统的分析技术如高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS）具有高灵敏度和特异性。然而，这些方法依赖于昂贵的仪器和熟练的操作人员，这限制了它们在实地或实时监测中的应用。酶联免疫吸附测定（ELISA）虽然更易获取且成本较低，但常常存在灵敏度有限、交叉反应和复杂食品基质干扰的问题。因此，亟需新的诊断平台，将稳健的性能与操作简便性结合起来，用于现场食品安全应用[11,12]。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术已成为分子诊断的强大工具，在食品安全、生命科学、临床检测和环境监测等领域具有广泛的应用[[13], [14], [15], [16]]。在各种CRISPR系统中，CRISPR/Cas12a因其独特的分子机制而特别适合用于生物传感[17,18]。当CRISPR/Cas12a识别到目标核酸时，会激活一种强大的切割活性，非特异性地降解附近的单链DNA（ssDNA）分子。这种切割效应可以被利用为高效的信号放大机制。通过引入荧光淬灭的ssDNA报告基因，其在目标识别时的切割会产生强烈且易于检测的信号[19,20]。此外，这些系统可以在等温条件下运行，并且可以在一小时内得出结果，非常适合即时应用[21,22]。然而，一个根本性的挑战是：由于霉菌毒素是非核酸的小分子，它们不能被CRISPR/Cas12a系统直接识别。克服这一障碍需要巧妙地整合生物识别元件，以连接霉菌毒素的存在和Cas12a的激活。
利用这种集成方法，已经开发出多种创新的CRISPR/Cas12a平台用于霉菌毒素检测，显示出高灵敏度和特异性[23,24]。这些系统正迅速成为整个食品生产和分销链中有前景的诊断工具。在本综述中，我们全面概述了该领域的基本原理和最新进展（图1）。我们系统地分析了这些生物传感器的核心功能组件。首先，我们研究了主要的生物识别策略，主要是使用抗体和适配体，将霉菌毒素检测与核酸信号联系起来。其次，我们探讨了用于进一步提高灵敏度的各种信号放大技术。最后，我们总结了多种信号读出方法，将分子反应转化为可量化的结果，从荧光检测到电化学和比色检测。综述最后讨论了当前面临的挑战以及未来发展方向，以开发稳健的、可在现场应用的CRISPR/Cas12a驱动的霉菌毒素诊断技术。
部分摘录
食品中的霉菌毒素概述
霉菌毒素是一类由多种真菌产生的有毒次级代谢产物，对全球食品安全和人类健康构成了重大且普遍的威胁[25]。在食品生产和供应链过程中，由于储存条件不当（尤其是高湿度和高温），为真菌繁殖和随后的毒素生物合成创造了有利环境，导致霉菌毒素的积累风险尤为严重。
信号放大
如前一节所述，将霉菌毒素识别事件成功转化为核酸信号是检测的基础步骤。然而，对于痕量污染物的检测，这种一对一识别事件产生的初始信号通常不足以产生稳健且可量化的结果[[54], [55], [56]]。为了克服这一限制并显著提高检测灵敏度，已经开发了多种信号放大策略
信号读出方法
一旦初始的生物识别信号被有效放大，导致ssDNA报告基因的大规模切割，就需要进行最后一步关键操作：将这一分子事件转化为可测量和可解释的信号。CRISPR/Cas12a系统的多功能性进一步体现在其兼容多种信号读出方式上，每种方式在灵敏度、成本和适用于即时检测方面都具有独特优势
当前面临的挑战
尽管取得了有希望的结果，但从概念验证到实际应用的转变仍面临一些关键障碍，这些障碍限制了灵敏度和可靠性。
一个主要挑战是系统兼容性。上游信号放大策略所需的最佳条件（如缓冲液组成和温度）可能与CRISPR/Cas12a反应所需的条件不一致。这种内在冲突需要仔细的集成优化
CRediT作者贡献声明
魏思怡：撰写——初稿，软件开发。谢颖书：撰写——初稿，软件开发。姜康妮：软件开发。李志新：指导。邓晓宇：指导。徐少华：指导。姜帆：撰写——初稿。陶英洲：撰写——审稿与编辑，指导，软件开发，项目管理和资金申请。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本项目得到了国家自然科学基金（编号22264018）、江西省自然科学基金（编号20224BAB213005、20232BAB203019和20232BAB216118）以及中国中医药大学博士科学研究基金（编号2022BSZR008、2021BSZR013和2020BSZR006）的支持。
