PRPF40B通过调控NTRK2选择性剪接控制神经分化与突触可塑性的新机制

《Cell Death & Disease》：Regulation of NTRK2 alternative splicing by PRPF40B controls neural differentiation and synaptic plasticity

本研究揭示了剪接因子PRPF40B在神经发育中的关键作用。为解决TRKB受体亚型失衡导致神经分化障碍的难题，研究人员发现PRPF40B通过促进NTRK2基因产生全长TRKB-FL而非截短体TRKB-T1，从而调控BDNF信号通路。该发现为阿尔茨海默病、帕金森病等神经精神疾病的治疗提供了新靶点。

　　

大脑的正常发育和功能维持依赖于精确的基因表达调控，其中选择性剪接（alternative splicing）是产生蛋白质多样性的关键机制。在神经系统中，脑源性神经营养因子（BDNF）与其高亲和力受体TRKB（Tropomyosin receptor kinase B）的结合，激活下游MAPK/ERK和PI3K/AKT等信号通路，对神经元存活、分化以及突触可塑性至关重要。TRKB由NTRK2基因编码，该基因通过选择性剪接可产生全长受体（TRKB-FL）和缺乏激酶结构域的截短亚型（TRKB-T1）。TRKB-T1作为显性负调控因子，通过竞争性结合BDNF抑制TRKB-FL的功能。研究表明，TRKB-T1/TRKB-FL的比例失衡与阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）以及精神分裂症等多种神经精神疾病密切相关。然而，调控NTRK2选择性剪接以维持TRKB亚型平衡的关键分子机制此前尚不明确。

先前已知的唯一与NTRK2调控相关的RNA结合蛋白是Rbfox1，但其主要通过稳定TRKB-T1 mRNA而非影响剪接过程发挥作用。因此，寻找能够直接调控NTRK2选择性剪接的关键因子，对于理解相关疾病的发病机制和开发新的治疗策略具有重要意义。PRPF40B（PRP40 pre-mRNA processing factor 40 homolog B）是一个在神经系统中高表达的剪接因子，其基因突变或表达异常与多种神经退行性疾病和精神病理性状相关，提示它可能在神经系统中扮演重要角色。基于此，研究人员推测PRPF40B可能是调控NTRK2剪接和神经元功能的关键分子。

为验证这一假说，研究人员主要运用了CRISPR/Cas9基因编辑技术在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中构建PRPF40B敲低细胞系，并利用RNA-seq转录组测序分析差异表达基因和选择性剪接事件。通过体外神经元诱导分化模型（使用视黄酸RA和BDNF依次处理）、蛋白质印迹（Western blot）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、免疫荧光、细胞增殖/迁移/凋亡/周期分析等技术，系统评估了PRPF40B对细胞表型和信号通路的影响。此外，研究还通过CRISPR/Cas9技术构建了Prpf40b基因敲除（Prpf40b^-/-）小鼠模型，以在体研究PRPF40B在胚胎早期神经发生过程中的作用。

Silencing of PRPF40B inhibits proliferation, colony formation, and induces cell-cycle arrest in human NB cells in vitro

研究人员首先在SH-SY5Y细胞中利用CRISPR/Cas9技术构建了两个不同敲低效率的PRPF40B沉默细胞系（G1和G2）。结果表明，PRPF40B沉默会显著抑制细胞增殖、降低集落形成能力，并导致细胞周期阻滞在G0/G1期，但不影响细胞凋亡。利用shRNA再次敲低PRPF40B或在其沉默细胞中回补PRPF40B均能重复或逆转上述表型，证实了PRPF40B对细胞增殖的直接调控作用。

PRPF40B silencing affects NB cell migration and differentiation in vitro

进一步研究发现，PRPF40B沉默还损害了SH-SY5Y细胞的迁移能力。在利用RA和BDNF诱导神经元分化后，PRPF40B沉默细胞表现出神经元标志物β-微管蛋白III（β-tubulin III）和磷酸化黏着斑激酶（p-FAK^Y397）表达水平的降低，以及细胞生长面积的减小，表明其神经元分化过程受损。

PRPF40B regulates gene transcription in NB cells

通过RNA-seq转录组分析，研究人员在PRPF40B沉默的SH-SY5Y细胞中鉴定出2243个差异表达基因，其中1504个基因上调，739个基因下调，提示PRPF40B主要发挥转录抑制因子功能。功能富集分析显示，这些基因参与神经递质释放、细胞迁移、细胞外基质组织等关键生物学过程。

PRPF40B regulates alternative RNA splicing in NB cells

作为剪接因子，PRPF40B的沉默影响了233个选择性剪接事件，涉及200个基因，其中以外显子跳跃（exon cassette）和可变第一外显子（alternative first exon）最为常见。对PRPF40B调控的外显子进行分析发现，其下调的外显子通常更小，具有较弱的受体剪接位点，且分支点（branch point）与受体位点之间的距离更长。

PRPF40B regulates critical signaling pathways involved in neuronal differentiation

在神经元分化过程中，MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路被激活。然而，在PRPF40B沉默的细胞中，这些通路的关键组分（如ERK1/2, p-ERK, AKT, p-AKT, PI3K）及其下游与突触功能和细胞骨架重塑相关的靶蛋白（如N-钙黏蛋白N-cadherin、突触素synaptophysin、突触蛋白synapsin 1a/b、β-tubulin III、Drebrin）的表达水平均显著降低。同时，PRPF40B本身的表达在WT细胞分化过程中上调，强调了其在神经元分化中的重要性。

PRPF40B regulates the expression of the TRKB-T1 splice variant in vitro

核心发现显示，在分化过程中，WT细胞的TRKB-FL和TRKB-T1蛋白表达均增加。然而，在PRPF40B沉默的G2细胞中，TRKB-FL蛋白几乎检测不到，而TRKB-T1蛋白却显著增加。mRNA水平分析证实，PRPF40B沉默导致总TRKB转录本增加，且剪接平衡向TRKB-T1亚型严重倾斜。生物信息学分析表明，PRPF40B沉默促进了NTRK2 pre-mRNA中第16号外显子（exon 16）的包含，该外显子引入提前终止密码子，导致产生截短的TRKB-T1。在PRPF40B沉默细胞中回补PRPF40B，可以恢复TRKB-FL的表达和下游信号通路的活性，并提升突触素表达，证明PRPF40B缺失导致的表型是可逆的。

PRPF40B regulates the expression of the TRKB-T1 splice variant in vivo during early neurogenesis

在体研究证实了PRPF40B在胚胎早期神经发生中的作用。在E10.5天，Prpf40b^-/-小鼠胚胎表现出神经元祖细胞增殖减少（Ki-67标记降低），且TRKB-FL和TRKB-T1蛋白水平均低于WT对照。到E14.5天，虽然两种TRKB亚型的蛋白水平在WT和敲除胚胎间趋于一致，但mRNA分析再次显示，敲除胚胎中TRKB-T1的比例显著高于TRKB-FL，这与体外细胞实验的结果一致。

综上所述，本研究首次鉴定出剪接因子PRPF40B是调控NTRK2基因选择性剪接的关键调控因子。PRPF40B通过促进TRKB-FL而非TRKB-T1亚型的产生，确保BDNF/TRKB信号通路的正常激活，从而维持正常的神经元分化、突触可塑性和功能。PRPF40B的功能缺失会导致TRKB-T1亚型异常上调，破坏神经滋养信号，这可能是多种神经精神疾病中共有的病理机制之一。

该研究的重大意义在于：1）揭示了PRPF40B-TRKB轴在神经发育和功能中的全新调控机制；2）为理解多种神经退行性疾病和精神疾病中BDNF信号通路失调提供了新的分子解释；3）提出了通过靶向PRPF40B或NTRK2剪接来纠正TRKB亚型失衡的创新治疗策略，例如设计反义寡核苷酸（ASOs）来阻断 exon 16 的剪接，从而增加TRKB-FL的表达。此外，研究还暗示PRPF40B可能具有超越传统剪接调控的功能，例如参与转录调控，这为未来研究开辟了新的方向。这项发表在《Cell Death & Disease》上的工作，不仅深化了对选择性剪接在神经系统中重要作用的认识，也为相关疾病的治疗带来了新的希望。